狂犬病疫苗診斷��

 

 (1)標本采�。翰扇�瀕死期瘋動(dòng)物或死于狂犬病患者尸體的延腦、海馬回、脊髓和唾液腺，置滅菌容器，在冷藏條件下運送至實(shí)驗室。如系唾液或脊髓液，則應低速離心后，取上清液，加入青霉素(1000U/ml)和鏈霉素(1000μg/ml)，并酌量加入滅活牛血清，約2%。標本的運送和保存，要求及時(shí)、冷藏，以保證診斷準確可靠。�ツX組織標本分作三份：一份作壓印片，供顯微鏡和熒光抗體檢查或酶聯(lián)免疫吸附試驗用；一份用10%甲醛溶液浸泡，作病理學(xué)檢查；一份作病毒分離用。如果組織已經(jīng)腐敗變質(zhì)，則只能作病毒分離。

��(2)壓印片檢查：切取海馬回，置吸水紙上，切面向上，用載玻片輕輕按壓切面，制成壓印標本，室溫自然干燥后染色鏡檢——檢查特異包涵體，即涅格里氏小體。染色時(shí)，在已固定的標本上滴加染色液(4%堿性復紅飽和無(wú)水甲醇溶液3.5ml,2%美藍飽和無(wú)水甲醇溶液15ml,無(wú)水甲醇35ml依次混合而成)數滴l8～10秒，流水沖洗，待干后鏡檢。涅格里氏小體位于神經(jīng)細胞胞漿內，直徑3～20μm不等，呈梭形、圓形或橢圓形，呈嗜酸性著(zhù)染——鮮紅色，但在其中�？梢�(jiàn)到嗜堿性(藍色)小顆粒。神經(jīng)細胞染成藍色，間質(zhì)呈粉紅色，紅細胞呈橘紅色。如果檢查小鼠腦內的包涵體，必須注意與其它病毒感染引起的胞漿內包涵體相區別，后者大小均勻，不象涅格里氏小體那樣大小懸殊。檢查狗腦時(shí)，應注意與偶而存在的犬瘟熱病毒引起的包涵體區別。檢出涅格里氏小體，即可診斷為狂犬病。但是必須指出，并非所有發(fā)病動(dòng)物腦內都能找到包涵體。狗腦的陽(yáng)性檢出率為70%～90%，人腦約70%。

��(3)熒光抗體檢查：如上制造壓印片2張，待干后，于-20℃用丙酮固定4小時(shí)后應用。�ジ呙庋�清是用固定毒多次接種家兔、豚鼠或綿羊而制備的。按常規法提取IgG，并標記熒光素，測定最適稀釋度后應用。近年來(lái)常采用抗狂犬病毒單克隆抗體進(jìn)行標記。�ゲ×蠙z查通常按阻斷對比法進(jìn)行，即取3～5倍濃度的工作價(jià)熒光抗體(如某批熒光抗體的工作價(jià)為1：20稀釋度，則取其4～7倍稀釋液應用)，分裝于2支小試管內，分別等量加入正常鼠腦懸液及狂犬病毒感染鼠腦懸液。37℃感作30分鐘。中間振蕩數次,此后離心沉淀,吸取上清液應用。分別滴加1～２滴于上述2張壓印片上,37℃　30分鐘。用pH7.2PBS泡洗10分鐘，然后用緩沖甘油封載后鏡檢。如果以正常鼠腦懸液吸收的熒光抗體染色的壓印片呈特異性熒光(胞漿內亮黃綠色的熒光顆�；驘晒獍邏K)，而以感染鼠腦懸液吸收的熒光抗體染色的壓印片不出現特異性熒光染色，即可確診為狂犬病。也可以將腦組織印片或涂片或作病理切片，固定后，滴加熒光標記抗體，感作處理后鏡檢。如有翠綠色顆�；虬邏K熒光即可確診。此外，可以將特異性抗體包被在載體玻片上，用腦或唾液上清與抗體反應后，再用熒光抗體染色，鏡檢。還可采用間接熒光免疫技術(shù)進(jìn)行檢測。熒光抗體檢查必須設置已知陰、陽(yáng)性標本對照,鑒定特異性。

��(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗：先用抗狂犬病毒陽(yáng)性血清或IgG包被40孔板，加待測腦懸液，再用標記HRP的陽(yáng)性IgG進(jìn)行反應。亦可采用特異性抗體作為一抗與被檢樣品反應，然后再與酶標二抗進(jìn)行反應。同時(shí)，設陽(yáng)性及陰性抗原對照，如被測樣品出現特異性顯色，即可診斷為狂犬病。