禽痘病毒屬 (Auipoxuirus)
禽痘病毒是感染禽類(lèi)的病毒，種間具有交叉血清學(xué)反應。通常不感染人與其它哺乳動(dòng)物。禽 痘病毒，特別是雞痘病毒是主要的病原體，使養雞業(yè)遭受重大損失。 病毒粒子內含有大量脂質(zhì)，但對乙醚有抵抗力。禽痘病毒于感染細胞內產(chǎn)生A型包涵體。 禽痘可由吸血昆蟲(chóng)機械傳播。 本屬包括雞痘病毒、鴿痘病毒、金絲雀痘病毒、燕八哥痘病毒和火雞痘病毒等。雞痘病毒是 其代表種。
(一) 雞痘病毒(Fowlpox virus)
同義名：禽痘病毒，傳染性上皮瘤病毒，雞白喉病毒。雞痘病毒主要侵害雞，引起皮膚型痘和粘膜型病變，后者即所謂的雞白喉。 各種年齡和品種的雞都易感，但雛雞的敏感性最高。 18世紀以前，雞痘一直是養禽業(yè)的重要傳染病之一。世界上許多養禽地區幾乎都曾流行過(guò) 本病。我國農區亦常見(jiàn)有本病發(fā)生，但因普遍采用疫苗接種措施，雞痘的發(fā)生率已經(jīng)明 顯下降。 雞痘多發(fā)于秋冬和早春。 除雞外，野雞(雉)和火雞也可感染，鴿也有時(shí)發(fā)生。鴨和鵝等水禽很少發(fā)生，即使感染，也 無(wú)嚴重癥狀。
〖BT4〗 1、形態(tài)和理化學(xué)特性 病毒粒子即原生小體，又稱(chēng)Borrel小體，大小為280×330nm，表面呈現桑椹樣。于超 薄切片中，病毒中心為電子密度高的核心，即類(lèi)核體。核心對胃蛋白酶有抵抗力，呈 現 兩面凹盤(pán)狀，由折疊或卷曲的管狀結構組成，與假牛痘病毒的S狀結構相似，側體分別位于 核心的兩個(gè)凹陷內。核心和側體外面包圍有2～3層外膜(圖31-2)。 在感染細胞的胞漿內包涵體中，可以看到大量的原生小體，故使包涵體呈現Feulgen陽(yáng)性染 色。〖HT5”SS〗〖JZ〗圖31-2 雞痘病毒〖WB〗電鏡照片〖DW〗——自李成等 〖HT5SS〗 病毒粒子核心中含有雙股線(xiàn)狀DNA基因組長(cháng)約300kb,G+C=35%。雞痘病毒DNA不具有感染性。D NA末端，同痘苗病毒一樣，具有單鏈的發(fā)夾結構，由于這一結構的存在，原始基因組和末端 的酶切片段，經(jīng)堿和加熱變性后，很快可以復性。對痘病毒科內不同屬中的一些成員進(jìn)行基 因組酶切圖譜分析，發(fā)現它們之間具有相似性，基因組中間部分的核苷酸序列比較保守 ，而基因組的兩端在長(cháng)度和核苷酸序列上差異較大。一般認為，基因組內部結構，即保守 區的DNA序列，編碼病毒DNA復制、轉錄和增殖等一些重要酶類(lèi)，兩端的側翼區與病毒的毒 力、宿主范圍相關(guān)，具有病毒種屬特異性。 雞痘病毒類(lèi)脂含量極高，占其重量的1/3，其中約一半為角鯊烯。 現已分析出雞痘病毒的28種多肽，分子量由10～135kDa不等。 Mishrq等(1994)應用聚丙烯酰胺凝膠電泳對雞痘病毒疫苗株(TVRJ)和兩株自然分離株進(jìn)行 蛋白質(zhì)分析，結果表明，三株病毒在75%～15%凝膠中電泳，考馬斯亮藍染色分別產(chǎn)生45、 37 、39三條帶。免疫斑點(diǎn)試驗證明，大多數的蛋白質(zhì)多肽，具有免疫原性。但疫苗株與分離株 ，分離株與分離株之間在蛋白質(zhì)抗原性方面有所不同。 雞痘病毒抵抗乙醚，對氯仿敏感，但曾報道某些毒株對乙醚的抵抗力不強，雞痘病毒可耐1% 石炭酸和1∶1 000福爾馬林達9天之久。雞痘病毒對干燥具有強大抵抗 力，痂皮內的病毒可以 活存幾個(gè)月。但在雞糞和泥土中，活力通常不超過(guò)幾周。60℃和50℃加熱，分別可在10分 鐘 和30分鐘內使其滅活。對于已由包涵體中脫出的病毒粒子，1%～2%苛性鉀或苛性鈉呈現明顯 的滅活作用。 冷凍干燥和50%甘油鹽水可使雞痘病毒長(cháng)期保持活力達幾年之久。
〖BT4〗2.培養 電鏡觀(guān)察雞胚絨毛尿囊膜上的雞痘病毒感染，可見(jiàn)病毒在感染后2小時(shí)內即被絨毛尿囊膜的 外胚 層細胞吞飲。經(jīng)48小時(shí)的潛伏期，于胞漿內散在的“工廠(chǎng)區”內出現未成熟的病毒粒子。 病毒粒子由雙層膜圍繞，中心為類(lèi)核體。感染72小時(shí)后，胞漿中出現由許多層緊密編織的中 心性膜組成的髓鞘結構，又稱(chēng)微管結構。于感染后96小時(shí)出現包涵體，包涵體內含有成熟的 病毒粒子。約于感染后120～140小時(shí)，病毒粒子脫離包涵體，移向胞膜，并從細胞表面出芽 ，又獲得一層厚厚的外膜。 雞痘病毒易在雞胚絨毛尿囊膜上生長(cháng)，并可于3天內產(chǎn)生白色隆起的大型痘斑。痘斑中心隨 后壞死，色澤變深。 雞痘病毒易在組織培養的雞胚細胞內增殖，產(chǎn)生明顯的細胞病變，并可在感染細胞的胞漿內 看到包涵體。
〖BT4〗3.血凝性 雞痘病毒具有血凝性。細胞培養物內的病毒增殖可用血細胞吸附試驗測出。
〖BT4〗4.病原性 皮膚型雞痘潛伏期為4～8天。病毒侵入皮膚后，由于病毒增殖，上皮細胞增殖而在雞冠、肉 髯以及口角、 鼻孔和眼周?chē)钠つw上出現增殖性病變——紅色突起的圓斑，繼則變?yōu)樯掀ち�，直徑約5～6 毫米。這些病變在觸摸時(shí)有堅硬感，呈現灰黃色。1～2天后，痘上皮瘤由痂皮被覆。在第一 批痘病變附近又發(fā)生新的痘疹，結果在冠和肉髯表面形成一大片的痂皮。痘病變也可能出 現于眼結膜、角膜以及體軀其它部位的皮膚上。痂皮脫落部形成瘢痕，有時(shí)成為久不愈合的 潰瘍。病程約3～4周。病雞消瘦，產(chǎn)蛋停止，常需1～2個(gè)月才能恢復。 除上述的皮膚型雞痘外，還常見(jiàn)到白喉型雞痘。先在口腔和咽喉部粘膜表面出現黃白色稍 突起的小結節，隨后增大融合而成一層黃白色干酪樣假膜，覆蓋于粘膜表面。撕去假膜， 則露出紅色的出血性潰瘍面。假膜擴大和增厚，可能阻塞口腔和咽喉，導致呼吸和吞咽困難 ，病雞發(fā)出咯咯聲。白喉型的死亡率較高，有時(shí)達30%～50%。 取病變部作組織學(xué)檢查，感染上皮細胞呈典型的空泡化或發(fā)生水腫樣變性，胞漿內有大型 的嗜伊紅性包涵體。Allwright等(1994)報道有2群駝鳥(niǎo)發(fā)生禽痘病毒感染，臨床癥狀 與雞痘相似，并從病變組織中分離出雞痘病毒。將含病毒材料涂于劃破的冠、皮膚和粘膜 上時(shí)，幾乎可使各種鳥(niǎo)類(lèi)發(fā)生實(shí)驗感染，癥狀與自然病例相似。
〖BT4〗5.生態(tài)學(xué) 雞痘主要因與病雞發(fā)生直接接觸而感染。白喉型病雞的呼吸道滲出液中含有大量病毒，可因 污染飲水、飼料和用具等而發(fā)生間接感染。雞痘病毒不能侵入未破損的皮膚和粘膜，所以一 般認為，感染是經(jīng)皮膚或粘膜上的微小擦傷或剌傷而發(fā)生的，但病毒也可以經(jīng)毛囊侵入。吸 血昆蟲(chóng)，包括蚊、蠅、蜱、虱等呈現一定的病毒傳播作用。野鳥(niǎo)及鴨、鵝等動(dòng)物在傳播疾 病中的作用尚待證實(shí)。
〖BT4〗6.免疫 康復雞具有終生免疫力。人工免疫預防也有良好效果。當前應用的疫苗有鵪鶉化弱毒疫苗 、雞胚化弱毒疫苗、組織培養弱毒疫苗和鴿痘疫苗等。 鵪鶉化弱毒疫苗：是將雞痘病毒連續通過(guò)鵪鶉胚致弱而育成的弱毒株。制苗時(shí)，將弱毒株接 種11～12日齡雞胚絨毛尿囊膜。4～5天后收獲水腫、增厚或有痘斑的絨毛尿囊膜，制成凍干 苗 或甘油苗。應用時(shí)剌種于雞的翅膀內側無(wú)血管處皮下，每只雞剌種一次。接種后約一周，局 部出現綠豆大痘皰，以后逐漸結痂。這種疫苗比較安全，免疫期約5個(gè)月。也可用于火雞。 雞胚化弱毒疫苗：是將雞痘病毒連續通過(guò)雞胚致弱而育成的弱毒株。這種疫苗的免疫原性較 好，免疫期6個(gè)月以上，但對幼雞常有較高毒力。組織培養弱毒疫苗：是將雞痘病毒連續 通 過(guò)細胞培養物減毒而育成的弱毒株，例如通過(guò)200～400代的HP1細胞培養，可供飲水免 疫，可用于5日齡雛雞，安全有效。但需在3～4周后作第二次免疫。也有將火雞痘病毒適應 豬腎細胞培養物40代而育成的弱毒株。 鴿痘疫苗：是一種異型疫苗，即用鴿痘病毒給雞接種。制苗時(shí)將鴿痘病毒接種雞胚絨毛尿囊 膜、雞胚細胞和鴨胚細胞培養物。這種疫苗比較安全，免疫期約6個(gè)月，也可用于火雞和鴿 。上述雞痘疫苗已被成功地與新城疫和/或馬立克疫苗聯(lián)合應用，但需用非腸道接種 途徑。 隨著(zhù)對雞痘病毒等禽痘病毒分子生物學(xué)研究的逐步深入，近些年來(lái)，研究開(kāi)發(fā)禽痘病毒，尤 其是雞痘病毒作為一種新的病毒載體，研究制備禽類(lèi)基因工程重組疫苗或哺乳動(dòng)物的非 復制型重組病毒疫苗，日益受到研究者的重視。已有多種病毒的保護性抗原基因，得到表達 ，如禽流感病毒HA基因、雞新城疫病毒的F、HN基因、馬立克氏病毒的PP38基因等。在美國 應用雞痘病毒為載體，研制的新城疫重組疫苗，已進(jìn)入免疫試驗階段。
〖BT4〗7.診斷 根據臨床癥狀和發(fā)病情況，�？勺鞒稣_診斷。應用組織學(xué)方法尋找感染上皮細胞內的大型 嗜酸性包涵體和原生小體，也有較大診斷意義。剪取痘病變組織，用切面在玻片上涂成涂 片后，用Mopoeov或Fontana法染色，極易見(jiàn)到單在、短鏈和成堆的原生小體。 (1)病毒的檢出和分離： 應用滅菌的剪刀切取痘病變部，深達上皮組織，以新形成的痘疹最好。將其制成超薄 切片后作電鏡檢查，直接檢查病毒粒子，或者用乳缽或組織研磨器研磨并低速離心后取其上 清液作負染后電鏡檢查。 分離病毒時(shí)，將痘病變組織置于滅菌乳缽內，加入石英砂后充分研磨，并加入Hanks液、生 理鹽 水或肉湯(每毫升含青、鏈霉素1 000單位或1 000微克)，作成10%乳劑。室溫感作1～2小時(shí) 后低 速離心沉淀，吸取上清作接種用。如為白喉型病變，則可撕取口腔或咽喉部的假膜，如上方 法制備乳劑。隨后用其接種雞胚、幼雞、雞胚細胞或雞胚腎細胞。 ①雞胚接種：選用9～12日齡雞胚，接種01毫升病料乳劑于絨毛尿囊膜上。接種后將雞胚 置3 7℃繼續孵育5～7天，檢查絨毛尿囊膜上是否出現白色灶狀痘斑。初代接種有時(shí)不出 現典型病變，可取接種部絨毛尿囊膜作組織學(xué)或電鏡檢查，或將其磨碎后作成乳劑，繼 續傳代適應。②幼雞接種：用細針將雞冠輕輕劃破，隨后涂抹上述乳劑。易感雞在接種5 ～10天后于接種部產(chǎn)生病變，并常擴散至冠和身體的其它部位。 ③細胞培養物接種：雞痘病毒易在原代雞胚細胞和雞胚皮膚細胞內增殖，并在接種后2～6天 內產(chǎn)生細胞病變——細胞變圓，折光性增強，隨后變性破壞。在接種后48小時(shí)出現胞漿內包 涵體。 分離獲得病毒以后，即可根據上述雞痘病毒的形態(tài)和理化學(xué)特性加以鑒定。 (2)血清學(xué)鑒定： 取自然或人工感染后1～2周的病雞血清作為免疫血清。將痘疹、痘皰、白喉型假膜或感染的 絨 毛尿囊膜作成乳劑后與抗雞痘免疫血清作瓊脂擴散試驗，�？稍�24～48小時(shí)內出現1～2條( 有時(shí)多 達5條)沉淀線(xiàn)。瓊脂凝膠由1%優(yōu)質(zhì)瓊脂、8%NaCl和001%硫柳汞配制而成。如將上述病料 乳劑先作超聲波處理，隨后加入1/2量的氟碳(Genetron 113)，勻漿化后，離心沉淀，吸取 上層水相。再加1/2量的碳氟重復如上處理，用其上層水相作抗原，可以明顯提高陽(yáng)性檢出 率。 這種初步提純抗原也可用于包被醛化紅細胞，作間接血凝試驗，用以檢測抗體�？贵w出現于 感染后1周，持續約15周。 以提純的雞痘病毒蛋白(10mg/ml)包被反應板，檢疫免疫接種或自然感染雞的血清抗體，具 有較高敏感性和特異性，可用于實(shí)際免疫監測。 如作中和試驗，可于病料乳劑中加入免疫血清，感作后接種雞胚或細胞培養物。 應用熒光抗體或酶標抗體檢測涂片或切片中的病毒粒子或病毒抗原，也可獲得較好結果。 〖BT(3+1〗
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