天花病毒和痘苗病毒��

天花病毒和痘苗病毒�� (Variola virus and vaccinia virus)

 〖HT5SS〗天花病毒引起傳播迅速的烈性傳染病——天花。天花曾是人類(lèi)歷史上的重 大災禍 之一。 由于使用痘苗病毒疫苗預防天花，1977年天花在全世界流行終止，1980年世界衛生組織 (WHO)宣布，天花已經(jīng)被消滅，不再用痘苗病毒疫苗預防天花。��

 [BT4] 1.形態(tài)和理化學(xué)特性�� 痘苗病毒粒子的浮密度在稀釋的緩沖液中為1��16g/cm����3��，在53%的蔗糖溶液中為1�豹� 25g/cm��3，在酒石酸鉀溶液中為1��2/cm��3。 重量為4��5×10����-15�猤。痘苗病毒和天花病毒在生理pH值時(shí)帶有負電荷，痘苗病毒 的等電點(diǎn)為pH4��0，而天花病毒則為pH3��4。�� 痘苗病毒和天花病毒的外形和大小十分相似，大小為270×218nm左右�？乖�性上也極相似 ，但二者毒力不同。

��[BT4]2.抗原性�� 天花病毒的抗原性與痘苗病毒極為相似，病變皮膚中的抗原，可用瓊脂擴散試驗和補 體結合試驗進(jìn)行檢測。機體感染這兩種病毒 1周后，可用中和試驗、補體結合試驗和血凝 抑制試驗進(jìn)行各種抗體檢測，但難以相互鑒別。��

 [BT4]3.培養�ヌ旎ú《竞投幻绮《究稍陔u胚絨毛尿囊膜上生長(cháng)，接種2～3日后天花病毒 形成1mm 左右的光滑痘斑，痘苗病毒為中心壞死的大痘斑。這兩種病毒能在雞胚細胞和其它一些原代 細胞及傳代細胞如HeLa等細胞中增殖，在培養細胞中，以細胞至細胞方式傳播。��

 [BT4]4.病原性�� 天花病毒經(jīng)上呼吸道侵入患者機體，潛伏期8～15天。在潛伏期間，病毒在淋巴樣組織中 增殖。病毒侵入機 體有后呈現如下的感染過(guò)程：①在侵入部附近的淋巴樣組織中進(jìn)行第一次增殖；②一過(guò)性病 毒血癥及 感染全身巨噬細胞系細胞；③在這些細胞中進(jìn)行第二次增殖；④第二次病毒血癥；⑤出現臨 床癥狀。�� 患者病初體溫升高，并有頭痛和四肢疼痛以及惡心、嘔吐等癥狀， 在發(fā)病第3～4天 開(kāi)始出疹。先是斑疹、丘疹、皰狀疹。1～4天后形成水泡，此后2～6日發(fā)展成膿皰，此時(shí)往 往由于機體吸收了壞死組織成分(并非細菌繼發(fā)感染)，而第二次發(fā)熱。病人在出現皮疹的 同時(shí) ，口腔、上呼吸道及食管上部粘膜也發(fā)生很多粘膜疹性小潰瘍，其中含有大量天花病毒， 并通過(guò)飛沫傳給易感者，這是天花病人排出病毒的主要方式。 皮膚上的膿皰逐漸干縮結痂，從病程的開(kāi)始到結痂脫落 ，需2～4周。結痂脫落后 留下紅色瘢痕，但瘢痕顏色隨后漸漸消退。升高的體溫常常在發(fā) 疹 后24小時(shí)內下降。病變多發(fā)生在面部，軀干部很少發(fā)生。天花在流行病學(xué)上分重型和輕型兩 種，重型死亡率高達15%～30%，輕型死亡率低于1%。天花病毒只感染人、猴和兔。天 花病 毒除引起人類(lèi)的嚴重感染外，以劃痕接種猴子，可引起典型皮疹。接種家兔皮內，引起明顯 的 局部病變，以劃痕法接種眼角膜，角膜上出現透明小圓皰，隨后因中 心部上皮脫落而形成凹陷。�� 痘苗病毒的宿主范圍較廣，它能引起人、牛、水牛、豬、猴、駱駝、象、綿羊、家兔及鼠 類(lèi)的感染。痘苗病毒疫苗株成功地用于天花的預防，但疫苗株痘苗病毒仍有一些缺陷和不足 。如常發(fā)生種 痘后疹，以及種痘后紫癜、壞疽痘，最大的問(wèn)題在于1/100萬(wàn)的種痘后腦炎(一過(guò)性腦炎 ) 和免疫缺陷患者的全身性發(fā)痘。�� 多年來(lái)的體外研究表明，痘苗病毒基因組中約1/3的基因，并非自身復制所必需，但體 內感染證明，某些非必需區是體內增殖必需的。對于痘苗病毒致病基因的研究表明，痘苗 病毒具有巧妙的生活方式，它有逃避機體免疫攻擊的機制。痘苗病毒合成的35 kDa分泌蛋白與C��4�璪結合，抑制經(jīng)典的補體激活途徑。痘苗病毒具有一定的抵抗干擾素的 作 用。另外，痘苗病毒還產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制痘苗病毒表達 的外源蛋白與抗體之間發(fā)生反應。痘苗病毒基因組中還存在著(zhù)與腫瘤壞死因子、白介素1和 白介素6受體相對應的ORF，推測其產(chǎn)物可能與這些細胞因子受體結合。�� 痘苗病毒TK基因和HA基因也屬致病基因。Paoletti等(1992)將痘苗病毒的TK、HA、ATI等1 8個(gè)基因進(jìn)行定向缺失，得到缺失變異株NYVAC，將其接種小鼠腦內，計算小鼠50%致死量 ，發(fā)現這種變異株比原始株的毒力弱1萬(wàn)倍。另外NYVAC株只在雞胚細胞中增殖，卻不能在 人源細胞株中增殖。��

 〖BT4〗5.免疫�� 天花痊愈后具有堅強的免疫力，可以持續終身，很少第二次患天花。�� 接種痘苗病毒后11～13天，可查到中和抗體、補體結合抗體和血凝抑制抗體，但抗體滴度很 低，持續時(shí)間較短。復種后7天，中和抗體滴度明顯增高。�� 一次成功的痘苗病毒接種完全免疫持續時(shí)間為2年，長(cháng)者可達5～7年或更久，此時(shí)雖可能發(fā) 生天花，但癥狀輕，病程短，死亡率低。��

 〖BT4〗6.診斷�� 利用電子顯微鏡負染技術(shù)，可以直接進(jìn)行快速診斷。即將丘疹和水皰期的病變部組織 接種雞胚絨毛尿囊膜可鑒定病毒 。天花病毒為小痘斑，痘苗病毒為中心壞 死的大痘斑，牛痘和猴痘為出血性痘斑。天花病毒在雞胚內生長(cháng)溫度的上界為38��5℃，而 痘苗病 毒溫度上界為41℃。天花病毒不能在雞胚成纖維細胞上形成蝕斑，而痘苗病毒則可形成蝕斑 。瓊脂擴散試驗、補體結合試驗可檢測抗原，中和試驗、補體結合試驗和紅細胞凝集抑制試 驗則可檢測抗體。病毒DNA酶切圖譜分析和病毒細胞感染肽圖分析也有鑒別診斷意義。��

 〖BT4〗7.痘苗病毒的起源�� 關(guān)于痘苗病毒的起源，學(xué)者們的意見(jiàn)不一致。有謂痘苗病毒是天花病毒連續通過(guò)兔體和犢牛 后形成的變異株，也有人認為痘苗病毒起源于牛痘病毒。有人甚至認為，Jenner的原始牛 痘毒株已被天花病毒污染，因此，痘苗病毒實(shí)際上是這兩種病毒的重組型。��

 〖BT4〗8.痘苗病毒的應用�� 1982年，Paoletti和Moss研究組將外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地構建了在 哺乳動(dòng)物細胞中表達外源基因的重組痘苗病毒。10多年來(lái)，應用重組痘苗病毒成功地表達了 來(lái)源于植物、動(dòng)物乃至人類(lèi)的數十種基因。重組痘苗病毒具有如下特點(diǎn)： ①重組痘苗病毒仍然保留野生型痘苗病毒的特性，感染幾乎所有源于哺乳動(dòng)物的培養細胞 ，并表達外源蛋白； ②被表達的外源蛋白，在感染細胞中，能忠實(shí)地進(jìn)行修飾； ③與其它病毒表達載體相比，具有較高的表達效率；④通過(guò)對動(dòng)物接種重組痘苗病毒的方 法，能了解外源蛋白對個(gè)體的作用以及機體的免疫應答； ⑤表達抗原基因的重組痘苗病毒�？勺鳛榛�因重組疫苗。�� 正因為有上述特點(diǎn)，痘苗病毒載體廣泛用于分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)領(lǐng)域以及新型 疫苗的開(kāi)發(fā)。

�� [BT4](1)基因組結構與復制�� 痘苗病毒基因組為兩端交叉閉鎖的線(xiàn)型雙鏈DNA分子，根據毒株的不同，其長(cháng)度變化在180k b～200kb之間，編碼約200種蛋白質(zhì)�；�因組的兩端向內，并有10kb的倒置重復序列，即序 列完全一致，方向相反，呈現倒置互補，其中含70bp～125bp的重復區。此70bp為痘苗病毒 的復 制所必需，其中20bp(ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT)尤為重要。此末端倒置重復序列變異較大，即 使同一毒株其結構亦不盡相同。這種兩端變異較大的序列，大多編碼非必需蛋白質(zhì)，但與病 毒毒力及宿主范圍有關(guān)。�� 在痘苗病毒基因組中央區域約有120kb的保守區，核苷酸變異較小，變異率在10%左右。晚 期基因大多集中于此區，主要編碼結構蛋白。痘苗病毒基因組含約198個(gè)主要ORF和65個(gè) 與其它基因重疊的小ORF，總共約含可編碼263種左右蛋白質(zhì)的潛在基因。痘苗病毒的閱讀 碼框架 間相距僅幾個(gè)至幾十個(gè)堿基，有的閱讀框架相互重疊�；�因組中無(wú)內含子，無(wú)基因編接機制 。 痘苗病毒增殖均在哺乳動(dòng)物細胞漿中進(jìn)行，并在20小時(shí)內完成一個(gè)病毒復制周期。過(guò)去 有人曾分離過(guò)無(wú)胸 苷激酶活 性(TK��-)和無(wú)血凝作用(HA��-)的痘苗病毒變異株。因此，目前為止人們常在TK基因或HA基 因中 插入外源基因進(jìn)行表達。痘苗病毒基因組左側20～30kb不穩定，在單純的反復傳代過(guò)程中 亦會(huì )發(fā)生某些基因的丟失。因此，也有人認為此區域為非必需基因群。

�� [BT4](2)重組痘苗病毒的制備�� Paoletti等首次利用標記拯救技術(shù)，制備了插入有外源基因的重組痘苗病毒。制備重組病毒 時(shí)，首先準備含有痘苗病毒非必需區基因的質(zhì)粒，在此非必需區中部插入痘苗病毒自身的啟 動(dòng)子(成為痘苗病毒表達載體)，啟動(dòng)子下游連接欲表達的外源基因。接著(zhù)對已感染痘苗病毒 1～2小時(shí)的細胞，轉化上述重組質(zhì)粒，使重組質(zhì)粒中所含的痘苗病毒非必需區序列與痘苗病 毒非必需區序列發(fā)生同源重組。外源基因在這一過(guò)程中重組到痘苗病毒基因組中，形成重組 痘苗病毒粒子。�� 應用磷酸鈣法進(jìn)行體內重組，得到的重組病毒只占全部子代病毒的0��1%左右，脂質(zhì)體法可 使重組率提高到0��3%～0��5%，而電激法又可提高重組率10倍以上。為了提高重組率，將重 組質(zhì)粒DNA與純化的痘苗病毒DNA 混合，共同轉化已感染痘苗病毒的細胞，可得到1/3的重組病毒。如果將重組質(zhì)粒NotI酶切 片 段與痘苗病毒DNA的NotI酶切片段進(jìn)行連接，進(jìn)行體內重組，則可得到1/4的重組病毒。�� 最常用胸苷激酶(TK)基因區作為外源基因插入痘苗病毒的非必需區，只需5’�蹭迕撗跄� 苷(BUdR)加壓即 可得到TK重組病毒。也常用血凝素基因(HA)作為插入外源基因的非必需區，此時(shí)用雞 紅細胞篩選HA重組病毒，但由于痘苗病毒的自然突變，存在著(zhù)TK��-和HA��-變異株，因此表 達 外源基因時(shí)應再增加篩選標志。例如利用β�舶肴樘擒彰富�因、新霉素抗性基因(Neo)、 鳥(niǎo)嘌呤 磷酸核糖轉移酶基因(gpt)等，可在培養液中加入X�瞘al、G418、霉酚酸等試劑，以便篩 選出重組病毒。��

 [BT4](3)疫苗制備�� 痘苗病毒載體已廣泛用于外源基因的表達調控研究，逐步成為常規表達外源蛋白的工具 。利用痘苗病毒載體進(jìn)行疫苗開(kāi)發(fā)研究主要有如下兩個(gè)大的方面。�� 首先，利用痘苗病毒表達外源基因生產(chǎn)多肽或亞單位疫苗。由于疫苗病毒表達的外源蛋白， 比細菌、酵母及多角體病毒表達系統更接近天然結構，病毒穩定性好，增殖滴度高，宿主范 圍廣，便于操作，且價(jià)廉容易生產(chǎn)。因此，如何構建和利用高效表達痘苗病毒載體系統成 為表達外源基因的關(guān)鍵一步。�� 其次，利用痘苗病毒載體進(jìn)行重組活疫苗的研究。由于重組痘苗病毒不僅誘導機體產(chǎn)生體液 免疫，而且誘導堅強的細胞免疫。痘苗病毒作為基因重組活疫苗載體，不需佐劑即 可 免疫動(dòng)物，病毒在體內增殖過(guò)程中產(chǎn)生的外源蛋白可剌激機體產(chǎn)生免疫反應。表達的外源蛋 白在細胞內被修飾后，與自身的組織相容性復合體(MHC)結合，剌激CD��+��8�睺淋巴細胞( 細胞毒性T淋巴細胞)。�� 重組痘苗病毒已用于人類(lèi)疾病的臨床研究，有些重組痘苗病毒活疫苗已處于免疫觀(guān)察階段。 在北歐，從1989年起野外投放狂犬痘苗重組病毒3次，到了1990年后半葉投放區野生狐貍 及 其周?chē)�家畜，已無(wú)狂犬病發(fā)生。猴免疫缺陷病毒(SIV)痘苗重組病毒接種猴體后可抵抗強毒 的攻擊。HIV��1痘苗重組病毒接種人體，亦已進(jìn)入臨床試驗階段。�� 痘苗病毒在基因重組活疫苗研究中的優(yōu)點(diǎn)之一，是可進(jìn)行多價(jià)基因重組疫苗的制備。由于痘 苗病毒的基因組容量大，可插入25Kb的外源基因而不影響自身復制。因此，可將不同的外源 基因，特別是各種病毒保護性抗原基因一同插入痘苗病毒基因進(jìn)行表達。這種嘗試已有成功 的報道。�� 總之，痘苗病毒無(wú)致癌性，穩定性好，宿主范圍廣，基因組容量大，非必需區多，能誘發(fā)機 體產(chǎn)生堅強的體液免疫和細胞免疫等都是其突出的優(yōu)點(diǎn)。雖然存在百萬(wàn)分之一的種痘后腦炎 和全身性發(fā)痘，但 隨著(zhù)對其基因組結構、功能的深入研究和改造，必將成為分子生物學(xué)、基因工程生物活性物 質(zhì)生產(chǎn)、基因重組疫苗及多價(jià)疫苗研究的有效工具。��