正粘病毒遺傳與變異
甲型流感病毒每個(gè)核苷酸在每個(gè)復制周期中的突變機率大約是15×10－5，與其它RNA病毒的突變率相似。但是，由于流感病毒的基因組分為8個(gè)或7個(gè)不相同的片段，在病毒增殖過(guò)程中很容易發(fā)生基因重排，因而使流感病毒的抗原性和致病性很容易發(fā)生變異。
(1)病毒變異的類(lèi)型A.抗原性變異〓抗原性變異是甲型流感病毒常見(jiàn)的一種自然變異，同時(shí)在實(shí)驗室內用抗體也可篩選到抗原變異株。變異率最高的是HA，其次是NA。這兩種抗原的變異可獨立發(fā)生，有時(shí)只涉及一個(gè)(HA或NA)，有時(shí)兩個(gè)同時(shí)發(fā)生變異。根據抗原性變異的程度可將其分為兩種：抗原漂移和抗原轉變。B.致病性變異a.條件致死性變種和溫度敏感(ts)變種：條件致死性變種是指在某種條件下不能增殖，但在另一種條件下卻能增殖并產(chǎn)生子代病毒的變種。這種可在一個(gè)或幾個(gè)不同基因片段上的任何一點(diǎn)發(fā)生突變或損傷，使其生物學(xué)特性發(fā)生改變。研究最多的是溫度敏感(ts)變種。ts變種能在33℃增殖，但和野毒株不同，37～39℃培養時(shí)不能增殖或增殖不好。ts變種通過(guò)基因重排、互補、變溫試驗以及RNA片段電泳遷移率測定等方法可以用來(lái)研究病毒的基因功能。另外，由于ts變種比野毒株的致病力弱，因此可用作減毒疫苗株或作為基因供體用于選擇弱毒株。b.冷適應變種：用野毒株感染雞胚在較低溫度下(25～30℃)培養，連續傳代后可較快地使病毒的致病力減弱。這一方法可用于減毒活疫苗株的選育和生產(chǎn)。c.新宿主適應變種：流感病毒在某種培養系統中連續傳代后，其增殖滴度和致病性均可逐漸升高，出現對新宿主的適應性變異。
(2)病毒的抗原性變異A.抗原漂移(antigenicdrift)〓由于基因組自發(fā)的點(diǎn)突變引起小幅度的變異，當氨基酸的改變積累到一定程度或突變氨基酸正好使抗原決定簇改變，則引起抗原性的變異，這種變異稱(chēng)為抗原漂移。由于RNA聚合酶缺乏校正功能，在病毒基因組復制時(shí)容易出現差錯，因此RNA病毒的突變率比DNA病毒高。流感病毒HA基因的變異率最高，據估計每個(gè)復制周期中每個(gè)核苷酸的突變機率為2×10－3，也就是說(shuō)病毒每復制一代，HA基因上大約有一個(gè)堿基發(fā)生變異。HA發(fā)生變異可能與抗體的壓力篩選有關(guān)，但其突變的準確機制還不清楚。用單克隆抗體對禽流感病毒HA的抗原性進(jìn)行分析，發(fā)現抗原漂移率比人流感病毒低，并且多種不同的變異株可同時(shí)在禽類(lèi)中循環(huán)存在。禽流感病毒HA變異率較低的原因可能是由于免疫系統對病毒變異的壓力不夠，因為已經(jīng)發(fā)現禽類(lèi)感染流感病毒后，其抗體持續時(shí)間較短。另外禽類(lèi)的壽命比人短得多。流感病毒的NA也常發(fā)生抗原漂移。如用單克隆抗體對A/Tokyo/3/67(H2N2)進(jìn)行篩選，在雞胚上傳一代即可篩選到突變株。B.抗原轉變(antigenicshift)〓由于突變幅度較大導致產(chǎn)生新的亞型，這種變異稱(chēng)為抗原轉變。變異涉及抗原的數量和幅度大小并常直接影響流行的規模。抗原轉變在人流感的發(fā)生歷史上表現很明顯，例如，1957年H2N2亞型的出現代替了H1N1亞型，1968年H3N2亞型毒株引起流感暴發(fā)，1977年又出現了H1N1亞型的流行。從HA的氨基酸序列來(lái)看，H2與H5的亞型比較接近，點(diǎn)突變的積累有可能造成兩者抗原性互相轉變，而H2與H3之間有很大差別，僅靠點(diǎn)突變使H2轉變?yōu)镠3可能需要相當長(cháng)的時(shí)間。為什么H3亞型能在10年左右的時(shí)間內取代H2出現流行?其原因有多種解釋。一種解釋認為，這種新流行的毒株是通過(guò)與其它動(dòng)物(包括禽類(lèi))流感病毒的基因發(fā)生重排而出現的。大量試驗已經(jīng)證明，不同亞型的病毒同時(shí)感染一個(gè)細胞，病毒基因組可在細胞中發(fā)生重排,即基因片段發(fā)生交換。研究表明，1957年和1968年流行的毒株就是由基因重排產(chǎn)生的。1957年毒株的HA和NA的基因序列與H1N1毒株有很大的差異，但經(jīng)序列分析和雜交試驗證明，其余6個(gè)片段中至少有5個(gè)片段基本相同，1968年流行的毒株與1957年流行的毒株的HA雖然不同，但含有相同的NA，都為N2。另外發(fā)現1968年毒株的HA(H3)與一株禽流感病毒的HA具有98%的同源性，因此推測新毒株的HA基因很可能來(lái)自禽流感病毒。第二種觀(guān)點(diǎn)認為，這種新流行的毒株可能在許多年前就已存在并流行過(guò)，但后來(lái)這一毒株隱藏在某個(gè)地方一直沒(méi)有發(fā)生變化，在適當的條件下這一毒株又“復蘇”增殖，引起新的暴發(fā)流行。例如1977年流行的H1N1亞型毒株與1950年流行的完全相同。如何解釋在長(cháng)達27年的時(shí)間內兩個(gè)流行株的基因沒(méi)有發(fā)生變化。有人認為動(dòng)物保藏宿主將這一毒株保存下來(lái)，最后又傳播給人造成流感暴發(fā)。但是在如此長(cháng)的時(shí)間內不發(fā)生抗原漂移，令人難以置信。另有人認為病毒基因插入宿主基因組，但目前看來(lái)這是一種無(wú)根據的假設。第三種解釋是病毒在自然界一直處于冰凍狀態(tài)中，沒(méi)有增殖的機會(huì )也就不會(huì )發(fā)生變異，但仍保持有感染性，遇有適當條件則重新造成暴發(fā)。另外一種解釋是動(dòng)物病毒發(fā)生變異，造成人的感染，引起新的流感暴發(fā)。但是，病毒基因組需要發(fā)生多大變化才能造成人的感染，目前還不清楚。
(3)流感病毒基因組變異
A.基因重排(reassortment)〓甲型流感病毒有8個(gè)基因組片段，當兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同病毒粒子同時(shí)感染一個(gè)宿主細胞時(shí)，在病毒的增殖過(guò)程中，不同毒粒的8個(gè)基因組片段可以隨機互相交換，從而發(fā)生核酸片段水平上的重新組合，這種現象就稱(chēng)為基因重排。甲型流感病毒的HA已鑒定出18種，NA已有10種。如果HA和NA基因能夠隨意重排，則可產(chǎn)生160種不同亞型的流感病毒。當細胞感染兩種不同的流感病毒后，通過(guò)基因片段的重排有可能產(chǎn)生256種遺傳學(xué)不同的子代病毒。在自然界，這種混合感染的現象很常見(jiàn)，通過(guò)基因重排有可能產(chǎn)生高致病力的毒株。不同毒株的基因出現重新組合這一現象是Burnet等在1949年最初發(fā)現的，他們用兩株不同的流感病毒感染小鼠后，發(fā)現HA的血清型和病毒的嗜神經(jīng)性發(fā)生了交換。1951年Henle等發(fā)現，當兩個(gè)或多個(gè)用紫外線(xiàn)照射后喪失感染能力的甲型流感病毒粒子同時(shí)吸附一個(gè)細胞后，可產(chǎn)生感染性的病毒粒子。這是因為紫外線(xiàn)照射可損傷不同的基因片段，而任何片段的損傷可使病毒的感染力喪失。但是當多個(gè)病毒同時(shí)吸附并進(jìn)入一個(gè)細胞后，通過(guò)基因交換可使缺陷基因的功能得到補充，從而產(chǎn)生出正常的有感染力的病毒粒子。具有不同缺陷的流感病毒粒子同時(shí)感染一個(gè)細胞后，在增殖時(shí)可發(fā)生基因交換，從而使缺陷彌補，這種現象為標記拯救。基因重排只能發(fā)生在同型病毒之間，在不同型病毒之間不能發(fā)生，即甲型流感病毒只能與甲型發(fā)生基因重排，與乙型或丙型流感病毒不能發(fā)生。因此基因重排與傳統的基因重組(Recombination)不同，基因重組時(shí)，發(fā)生基因斷裂、交換和連接三個(gè)過(guò)程，而基因重排不發(fā)生斷裂和連接，只有基因交換。
B.互補(complementation)〓流感病毒的任何一個(gè)RNA片段發(fā)生損傷都可造成該片段基因所編碼蛋白質(zhì)合成功能的缺陷，但可被具有該蛋白質(zhì)功能的其它流感病毒粒子彌補。例如溫度敏感變異株在編碼HA糖蛋白的基因片段上發(fā)生損害，在合適溫度(33℃)下增殖，仍可產(chǎn)生有完整功能的HA，但如在不適宜溫度下培養則不能合成有功能的HA，表現出HA功能的缺損。兩株不同的ts突變株，損害的基因片段可能不同，在限制溫度下兩株病毒都不能正常增殖。如果用兩株ts突變株同時(shí)感染一個(gè)細胞，即使在限制溫度下兩者都可以正常增殖,其原因是一株ts病毒所缺損的蛋白質(zhì)功能被另一株ts病毒相應的蛋白質(zhì)所補充，從而表現出完整的功能。在病毒增殖過(guò)程中，兩株病毒之間可通過(guò)基因重排而產(chǎn)生正常的病毒粒子。除了M和HA基因外，其它RNA片段還可發(fā)生片段內互補(intrasegmentalcomplementation)。片段內互補時(shí)缺陷片段產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含有兩個(gè)缺陷亞單位，但這兩個(gè)亞單位可互相彌補彼此的不足，從而表現正常的功能。編碼NS的片段8，有4個(gè)互補組，因此ts突變株的NS基因有基因內和基因間互補。NP基因之間有三個(gè)互補組，因NP基因是單順?lè )醋�，這些互補組僅是在基因內互補。
C.表型混合和核衣殼移植〓抗原性差別很大的兩株甲型流感病毒感染細胞后可產(chǎn)生表型混合(phenotypicmixing)的病毒粒子，如表型混合的病毒粒子含有兩個(gè)親代病毒的HA基因，在血凝抑制試驗或中和試驗中可被任何一種親代病毒的抗血清抑制或中和。有時(shí)在子代病毒中表型混合病毒粒子的比例可高達84%。這種現象不僅出現在不同的甲型流感病毒間，也可出現在甲型和乙型之間，甚至在甲型流感病毒與其它病毒之間發(fā)生，如與新城疫病毒或水泡性口炎病毒之間發(fā)生表型混合。核衣殼移植(transcapsidation)是指一種病毒的基因組由另一種病毒的囊膜包裝攜帶。比如用甲型流感病毒和水泡性口炎病毒混合感染細胞，流感病毒的囊膜可包裝水泡性口炎病毒的基因組，這種毒�？烧甲哟《镜�1%。
D.重排抑制和突變抑制〓與某一RNA片段有關(guān)的表型，由于基因重排被野生型病毒的其它基因片段改變，這種現象為重排抑制(suppressorreassortants)。例如，NS基因突變產(chǎn)生的ts表型，在基因重排時(shí)由于與野生病毒PB2基因發(fā)生交換而被抑制；PB1基因被野生病毒的替換也可抑制NS基因突變產(chǎn)生的ts表型。通過(guò)重排抑制的研究能夠確定病毒基因產(chǎn)物之間的相互作用。某個(gè)基因片段的突變可改變(抑制)與另一基因片段有關(guān)的表型，這種現象為基因外突變抑制(suppressormutants)。例如與PB2基因有關(guān)的ts表型可由于PA基因的突變而受到抑制。HA基因的ts突變可被基因外或基因內的突變抑制所彌補。
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