正粘病毒化學(xué)組成及其功能��

 正粘病毒化學(xué)組成及其功能��

 

流感病毒由68%～70%的蛋白質(zhì)、1%～2%的核糖核酸(RNA)、20%～25%脂質(zhì)和5%～8%的糖組成。病毒蛋白質(zhì)含有5種多肽，即血凝素、神經(jīng)氨酸酶、基質(zhì)蛋白、核蛋白和多聚酶。

�� (1) 正粘病毒基因組組成

〖HT5SS〗流感病毒的基因組是由8個(gè)分節段的單鏈、負股RNA組成，其中4、6號兩個(gè)節段編碼病毒囊膜糖蛋白，比較而言，丙型流感病毒僅編碼單一表面糖蛋白，因而丙型流感病毒的基因組由7個(gè)RNA節段組成。流感病毒基因組片段具有共同的特點(diǎn)：所有的RNA節段均具有相同的5’端，它由13個(gè)核苷酸所組成；3’端由12個(gè)高度保守的核苷酸組成，靠近3’端的第四個(gè)堿基，有些毒株為U，有的為C。在這些共同序列中，有部分序列可反向互補，這一點(diǎn)對病毒RNA的復制很重要；在每一節段靠近5’端15～21核苷酸處有一保守區，其序列為polyU。這一保守區在病毒mRNA合成時(shí)是產(chǎn)生polyA的信號。因為每一RNA節段的3’和5’端有部分序列互補,所以每個(gè)RNA節段呈鍋柄環(huán)狀。第1～6個(gè)節段各編碼一個(gè)病毒蛋白，7、8節段則編碼2個(gè)病毒蛋白，這樣甲、乙型流感病毒具有10種蛋白多肽，推論丙型流感病毒具有9種蛋白多肽，可目前僅證實(shí)8種。核酸具體編碼見(jiàn)表24-3。由于流感病毒的基因組分節段的結構特點(diǎn)，導致了基因組的易變性和具有很高的重組率。流感病毒RNA總分子量為59～63MD。甲、乙和丙型流感病毒基因組的大小和堿基組成不盡相同，AU∶AC的比率甲型為1:25；乙型為1:42；丙型為1:��46。提純的流感病毒RNA不具有感染性，需與一些具有多聚酶活性的蛋白結合在一起才具有感染性。��

 (2) 正粘病毒核蛋白(NP)

流感病毒的核蛋白，分子量約60kDa，是單體磷酸化的多肽，是構成核衣殼的主要成分。核蛋白具有型特異性，根據其抗原性的不同，可將流感病毒分為甲、乙、丙三型，它是可用補體結合試驗方法測定的型特異抗原，即可溶性抗原。它沒(méi)有感染性，在病毒粒子內部卷曲成螺旋狀結構，是病毒核酸外面的一種蛋白質(zhì)，但它并不把核酸完全包被起來(lái)，因而核衣殼仍對核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解后，核蛋白亞單位仍然存在，推測核蛋白自身形成一種內聚結構。�ズ说鞍资且环N多功能蛋白質(zhì)，除了形成病毒的核衣殼外，在病毒基因組的轉錄和復制中也可能起作用。在確定病毒的宿主特異性方面也有作用，例如根據對許多流感病毒NP基因的研究，可將它們分為5個(gè)不同的組，所有的禽流感病毒分為兩個(gè)組，馬流感病毒分為兩個(gè)組，豬流感病毒分在一個(gè)組。核蛋白的磷酸化取決于宿主細胞，與病毒感染的宿主譜有關(guān)。�ズ说鞍追肿又辽倬哂�3個(gè)獨立的抗原位點(diǎn)，借助于單克隆抗體和多克隆抗體進(jìn)行研究，發(fā)現所有被測毒株都有一個(gè)共同位點(diǎn)，針對這一位點(diǎn)的單抗可抑制病毒RNA分子的體外轉錄。�メ槍�核蛋白的單克隆抗體不能給動(dòng)物提供被動(dòng)保護，用提純的NP免疫動(dòng)物，也只能產(chǎn)生很微弱的抗感染能力，但NP是細胞毒性淋巴細胞識別的主要抗原。

 

基質(zhì)蛋白是一種非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA節段、丙型流感病毒的6RNA節段編碼。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的內側，也稱(chēng)為內膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有兩個(gè)讀碼框架，可轉錄出兩個(gè)mRNA，分別翻譯出一種蛋白質(zhì)。因此流感病毒的基質(zhì)蛋白有兩種，即M1和M2。��M1由252個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約26kDa，它是病毒的主要結構蛋白，占流感病毒蛋白總量的40%。這種蛋白也具有型特異性，其抗原性的差異是流感病毒分型的依據之一。M1位于病毒囊膜的類(lèi)脂雙層內側、核衣殼的外側，是維持病毒形態(tài)的結構蛋白。另外M1還可在感染細胞的細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜上發(fā)現。研究表明，M1的氨基端含有一親水區，羧基端與病毒的轉錄酶之間相互作用。�チ鞲胁《镜腗1具有多種功能，除維持病毒粒子的形態(tài)外，還能調節病毒轉錄酶的活性，另外在子代病毒粒子裝配過(guò)程中也起重要作用。據報道，M1單克隆抗體不能給動(dòng)物提供被動(dòng)保護。��M2由97個(gè)氨基酸殘基組成，分子量大約為15kDa，由片段7轉錄的第二個(gè)小mRNA翻譯出。M2也是一種跨膜蛋白，主要以四聚體形式存在于感染細胞的細胞膜上，另外也是病毒囊膜上的蛋白組分之一。每個(gè)病毒粒子大約含有14～68個(gè)M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成過(guò)程中作為質(zhì)子通道控制高爾基體內的pH值；在病毒脫殼時(shí)酸化病毒粒子的內部環(huán)境；另外在病毒裝配過(guò)程中也起作用。�チ鞲胁《綧2的氨基酸序列很保守，在所檢測的毒株中，其同源性高達90%。這種蛋白在感染細胞的細胞膜上與I類(lèi)糖蛋白相似，即氨基端在細胞外，羧基端在細胞內。細胞外部分為18～23個(gè)氨基酸，19個(gè)氨基酸殘基組成的疏水區插入細胞膜內，羧基端的54個(gè)氨基酸位于細胞質(zhì)內。氨基端的10個(gè)氨基酸非常保守，在所測的禽流感和人流感病毒中，其序列幾乎完全相同。�パ芯勘砻�，針對M2氨基端的單克隆抗體可抑制病毒蝕斑的增大，其作用方式與抗神經(jīng)氨酸酶抗體的作用方式相同。用這種單抗篩選突變株時(shí)，不僅引起M2的突變，還能引起M1的突變。

流感病毒的聚合酶由三種成分組成，它們是PB1、PB2、PA。這三種蛋白質(zhì)是病毒粒子中分子量最大的蛋白質(zhì)，分別為PB��196kDa，PB��287kDa，PA85kDa。這三種蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有一共同特點(diǎn)，都含有一特異的親核序列區，其作用是使這幾種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進(jìn)入細胞核。所以在感染細胞的細胞核內都可發(fā)現這三種蛋白成分。�チ鞲胁《揪酆厦笍秃象w在病毒粒子中所處的位置目前已經(jīng)清楚。三種蛋白質(zhì)位于病毒基因組的3’末端，免疫電鏡技術(shù)已直接觀(guān)察到這一復合體位于每一個(gè)核殼體的一端。�ゾ酆厦笍秃象w的三種成分分別由不同的基因組片段編碼。PB1由片段2編碼，共757個(gè)氨基酸殘基。其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐漸延長(cháng)；在模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)的合成過(guò)程中也靠PB��1的作用使合成鏈增長(cháng)。��PB2由片段1編碼，大約759個(gè)氨基酸殘基。其作用是在病毒mRNA轉錄的起始階段，識別并結合在5’端I型帽子結構。另外它還具有限制性?xún)惹忻富钚�，參與宿主mRNA帽子結構的切割。PB2在病毒cRNA和vRNA合成過(guò)程中的作用還不清楚，因為這些過(guò)程不需要宿主mRNA的帽子結構做引物。��PA由片段3編碼，由716個(gè)氨基酸殘基組成。在病毒RNA轉錄和復制過(guò)程中，PA與PB1和PB2��在一起隨鏈的延長(cháng)而移動(dòng)，因此推測PA與PB1和PB2共同構成RNA聚合酶復合體。但PA在病毒RNA合成過(guò)程中的作用還不清楚，有人認為可能是一種蛋白激酶或解旋蛋白。

��(5) 正粘病毒非結構蛋白(nostructuralproteins,NP)

甲、乙型流感病毒的非結構蛋白由片段8編碼，丙型流感病毒由片段7編碼。片段8或7也有兩個(gè)讀碼框架，可編碼兩種蛋白質(zhì)即NS1和NS2��，兩者的分子量分別為25kDa和12kDa。主要在胞漿內，在病毒粒子內不存在這兩種蛋白成分。流感病毒非結構蛋白的功能還沒(méi)有徹底搞清，可能在病毒復制過(guò)程中起一定作用，NS2��還可能有調節非結構蛋白合成的作用。�ピ诩毎�感染流感病毒的早期就可發(fā)現細胞核內有大量的NS1��聚集，另外還可在細胞漿內發(fā)現。NS2��合成較晚，主要存在于細胞胞漿，也可在細胞核內發(fā)現。�バ蛄蟹治霰砻�，NS1和NS2有70個(gè)氨基酸的重疊，并且在氨基端有9個(gè)氨基酸是相同的。NS1蛋白含有兩個(gè)核定位信號區，其中34～38位氨基酸殘基處的信號區非常保守，在所有甲型流感病毒中都相同。第二個(gè)信號區在203～237位氨基酸殘基處，在大多數甲型流感病毒中都有這一序列。野外分離的禽流感病毒的某些毒株，NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失現象。不同亞型毒株的NS在帶電性和磷酸化方面有很大差異。�ビ枚嗫寺】寡�清對NS1的抗原性進(jìn)行研究，結果發(fā)現，不同亞型毒株之間存在明顯的交叉反應。從人、豬、馬分離的甲型流感病毒，其N(xiāo)S1的抗原性非常相似，一般方法難以區分，而禽流感病毒株的NS1其抗原性有變異。

��(6) 正粘病毒脂質(zhì)層

由內、外兩層構成，緊靠于內膜蛋白之外。脂質(zhì)占病毒粒子總重量的20%～25%，使病毒對乙醚和其它脂溶劑敏感。HA和NA亞單位的疏水性末端即植入于這個(gè)脂質(zhì)層內。流感病毒的脂質(zhì)與副粘病毒相似，主要來(lái)自宿主細胞，由磷脂、膽固醇和三甘油脂組成，其中磷脂和膽固醇占95%以上。��

(7) 正粘病毒宿主抗原

在不同種動(dòng)物細胞中生長(cháng)的流感病毒粒子，帶有各該動(dòng)物細胞的宿主抗原。例如，在雞胚細胞中培養的病毒，給家兔進(jìn)行免疫注射，不僅使其產(chǎn)生抗病毒抗體，而且還能產(chǎn)生抗雞胚細胞的抗體。宿主抗原占病毒總重量的5%，分子量為15kDa，大部分是糖。宿主抗原連結于病毒表面蛋白上，可能是HA和NA的糖蛋白中的糖組分�？顾拗骺贵w主要針對宿主細胞的糖。��

(8) 正粘病毒血凝素

血凝素(HA)是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多種動(dòng)物紅細胞的性質(zhì)，借助HA對細胞受體的作用，使病毒附著(zhù)于細胞，在穿膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用。HA具有誘生中和抗體的能力，產(chǎn)生免疫保護作用。HA可以直接通過(guò)血凝反應檢測，其抗體可用血凝抑制、中和試驗、補反和ELISA方法來(lái)檢測。流感病毒的HA呈三角細長(cháng)的棒狀構造。HA為75kDa的糖蛋白，可水解成兩個(gè)獨立的肽鏈,兩個(gè)多肽由二硫鍵連接在一起。HA水解成HA1和HA2是感染的先決條件。HA的變異性很強，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。��HA由甲、乙型流感病毒RNA片段4編碼，是典型的I型糖蛋白。它含有4個(gè)結構域：信號肽(前導序列)、胞漿域、跨膜域和胞外域。免疫學(xué)和生物化學(xué)方法研究證明，HA在細胞內質(zhì)網(wǎng)合成。合成后由內質(zhì)網(wǎng)運送到高爾基復合體，最后到達細胞膜，嵌入胞膜的脂質(zhì)雙層，在病毒出芽釋放時(shí)被帶到病毒囊膜上。HA在運送過(guò)程中經(jīng)過(guò)不斷的修飾，如將N－葡萄糖苷寡糖加到天門(mén)冬酰胺殘基上，有些寡糖加上去后還經(jīng)過(guò)進(jìn)一步修飾。修飾的位置隨毒株不同而有區別。這樣形成的單體HA分布在內質(zhì)網(wǎng)膜上，在向高爾基體運送過(guò)程中，由二硫鍵連接并折疊成一定的形狀，隨后形成三聚體，由高爾基體運送到細胞膜。��HA產(chǎn)生后到其發(fā)揮作用時(shí)，還經(jīng)過(guò)幾個(gè)切割加工過(guò)程，包括N端信號肽的切除及HA1和HA2的產(chǎn)生。N端的信號肽約由16個(gè)氨基酸殘基組成，其作用是識別內質(zhì)網(wǎng)膜。HA合成后由信號肽酶將這一短肽切除，因此成熟的HA不含信號肽。另一個(gè)加工過(guò)程是將HA切割成兩條多肽鏈，產(chǎn)生HA1和HA2。切割時(shí)去掉一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，這與宿主細胞及毒株的毒力有關(guān)。HA1和HA2的分子量分別為36kDa和27kDa，兩條肽鏈被一個(gè)二硫鍵連在一起，再加上分子內的一些二硫鍵及其它非共價(jià)鍵的相互作用，使HA形成一定的立體結構。��HA的一級結構〓根據對不同亞型毒株HA的氨基酸序列測定及根據其片段4的核苷酸序列推測，HA大約由562～566個(gè)氨基酸殘基組成。在HA的氨基端有一由16個(gè)疏水氨基酸組成的信號肽，在加工過(guò)程中被信號肽酶切掉。緊接信號肽的328個(gè)氨基酸殘基是HA1部分，羧基端的221個(gè)氨基酸殘基構成HA2。在HA1和HA2之間有一精氨酸殘基，在加工過(guò)程中被切掉。經(jīng)過(guò)切割后產(chǎn)生的HA1和HA��2由一個(gè)二硫鍵和許多非共價(jià)鍵連在一起，兩條肽鏈之間的二硫鍵在HA1的14位和HA2137位的半胱氨酸之間形成。另外在HA1和HA2分子內還有其它的二硫鍵。HA2的羧基端(185～211氨基酸區域)主要由疏水氨基酸殘基組成，HA靠這一部分插入病毒囊膜的脂質(zhì)雙層。最末端的10個(gè)氨基酸殘基多數是親水性的，因此可伸出脂質(zhì)雙層進(jìn)入病毒粒子內。��HA是一種糖蛋白，每一個(gè)HA單體分子上帶有7個(gè)寡糖鏈，其中6個(gè)在HA1，1個(gè)在HA2。這些寡糖鏈都通過(guò)N－葡萄糖苷鍵與天門(mén)冬氨酸殘基相連。HA中寡糖的總量約占20%，主要由氨基葡萄糖組成，一些甘露糖形成枝狀結構，此外還有少量的巖藻糖，其最外端是半乳糖。在其它病毒糖蛋白的寡糖末端常帶有唾液酸(N－乙酰神經(jīng)氨酸)，但流感病毒沒(méi)有，這是由于病毒粒子含有神經(jīng)氨酸酶的緣故。�ァ　　∧壳皩Υ蠖鄶祦喰偷腍A已經(jīng)測序，通過(guò)序列比較發(fā)現半胱氨酸殘基在所有亞型的序列中都很保守。這表明它們從一個(gè)共同的“祖先”進(jìn)化而來(lái)，并且表明它們的結構都相似。通過(guò)部分氨基酸序列的比較發(fā)現，H1和H3亞型差別最大，僅25%的同源性；其它亞型之間的同源性較高，H2與H5亞型HA之間序列的同源性最高，為80%；相同亞型的不同毒株之間，HA序列的同源性在90%以上。�ァ　�HA的三維結構〓流感病毒囊膜表面的纖突是三個(gè)HA聚合在一起形成的三聚體。用去污劑將病毒粒子裂解后可分離到完整的HA纖突。當把去污劑除去后，HA分子靠其疏水端聚集在一起形成玫瑰花樣。用蛋白水解酶(如菠蘿蛋白酶)消化某些毒株，可分離到不完整的HA分子。HA纖突由三個(gè)HA單體分子組成，單體可分為兩部分，一部分是呈球狀的頭部，含有受體結合位點(diǎn)和抗原決定簇；另一部分為柄，與囊膜相連，長(cháng)約7.6nm。三聚體的總長(cháng)為13��5nm。用X線(xiàn)衍射技術(shù)對HA研究的結果表明，HA1的氨基端和HA2的羧基端位于分子的末端，并且靠近囊膜。球狀頭部由HA1組成，莖部由HA2和部分HA1組成。在HA頭部和莖部各單體之間都有局部接觸，這樣使之形成的三聚體更加穩固。�オ�

神經(jīng)氨酸酶是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA可水解細胞表面受體特異性糖蛋白末端的N－乙�；�神經(jīng)氨酸。病毒在細胞表面成熟時(shí)，NA可以移去細胞膜出芽點(diǎn)上的神經(jīng)氨酸，有利于病毒粒子的成熟和釋放。它具有免疫原性，能誘發(fā)相應的抗體。NA抗體可以抑制酶活性，并具有免疫保護作用。NA亞單位為四聚體，呈啞鈴狀，外端呈釘帽狀，大小為9×5nm，內端呈結節狀，直徑4nm，像樹(shù)根一樣植入于脂質(zhì)層內，兩端由一長(cháng)10nm的桿相連。NA亞單位的分子量為200kDa，它是由二個(gè)相同的并由二硫鍵連接的55kDa糖蛋白的二聚物，即由4個(gè)單體NA所組成，見(jiàn)圖24-4。NA的酶活性可以進(jìn)行定量測定。HA和NA是甲、乙型流感病毒的兩種糖蛋白，而丙型流感則有一種糖蛋白，即血凝素—酯酶(hemagglutinin－esterase，HE)，具有HA的特性，又具有NA的酯酶活性。但丙型流感不具有NA活性。用去污劑、脂溶劑或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、鏈霉蛋白酶)處理，可使NA纖突從病毒粒子上釋放下來(lái)。通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現釋放的NA纖突呈蘑菇狀。除掉去污劑后，這些纖突可通過(guò)疏水的莖部聚集在一起呈玫瑰花形。鏈霉蛋白酶處理釋放的纖突，具有完整的酶活性和抗原性。病毒囊膜上的NA纖突是NA單體形成的四聚體，它包括一個(gè)蘑菇狀的頭部和一個(gè)細莖。�オオ�

NA是一種糖蛋白，其蛋白部分由片段6編碼。目前對絕大多數亞型毒株的片段6序列已經(jīng)清楚，并能從基因序列推測出其氨基酸序列。通過(guò)對去污劑處理后釋放的NA進(jìn)行部分氨基酸序列分析，發(fā)現與基因推測的序列很一致。NA蛋白質(zhì)序列的特點(diǎn)是翻譯后不經(jīng)過(guò)切割；信號肽不被除去；翻譯起始用的蛋氨酸仍然存在；羧基端也不曾經(jīng)過(guò)加工。��NA與HA不同，它屬于II類(lèi)糖蛋白，即氨基端在囊膜內而羧基端在囊膜外，與HA正好相反。NA的一級結構包括4個(gè)區域，分別為氨基端胞漿尾、非極性跨膜區、莖部和頭部序列。NA的氨基端胞漿尾包括6個(gè)氨基酸殘基。根據目前所檢測的不同亞型的NA序列，發(fā)現氨基端胞漿尾非常保守，在所有的甲型流感病毒中都相同。這表明這一序列可能具有重要功能，但其真正功能目前還不清楚。NA的非極性跨膜區包括氨基端7到35位的氨基酸殘基，其中前6個(gè)比較保守，其余23～25個(gè)氨基酸變異較大。�ビ萌ノ蹌┖玩溍沟鞍酌柑幚硖崛�NA后進(jìn)行序列分析，證明非極性跨膜區的作用是將NA固定于脂質(zhì)雙層；NA合成后在內質(zhì)網(wǎng)的運輸過(guò)程中，這一序列起信號肽的作用。非極性跨膜區的長(cháng)度在不同的亞型之間有差別。NA的莖部長(cháng)度及序列在不同的毒株也有很大的差異。莖部的主要功能是幫助形成NA四聚體，當四聚體形成后，用鏈霉蛋白酶可將其莖部切下，而剩余的四聚體頭部仍可保持正常的結構，并且抗原和酶活性都不受影響。莖部是否還有其它功能，目前還不清楚。��NA的頭部序列在不同亞型的毒株有較高的同源性(46%)，這一點(diǎn)與莖部和非極性跨膜區不同。用鏈霉蛋白酶處理將NA莖部和跨膜區除去，獲得NA的四聚體頭部，通過(guò)X線(xiàn)晶體衍射技術(shù)研究表明，四聚體頭部大小為10��0×10��0×6��0nm，由4個(gè)相同的單體構成。每一個(gè)單體由6個(gè)β折疊組成，每個(gè)折疊又由4條反平行排列的肽鏈組成。每個(gè)折疊的立體構型都相同，呈螺旋槳葉片狀，按逆時(shí)針?lè )较蚺帕�。連接β－鏈的莖環(huán)結構在不同亞型之間的差異，其氨基酸的變化是造成NA酶活性和抗原性變異的原因。NA酶活性的催化中心位于頭部頂端，呈凹隱狀，每個(gè)NA單體都有一個(gè)，所以HA纖突具有4個(gè)催化中心。研究表明，每個(gè)NA纖突有4個(gè)抗原位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)又含有多個(gè)抗原決定簇。