流行性乙型腦炎病毒的分離和鑒定

  根據乙型腦炎明顯的季節性和地區性及其臨床特征，例如高熱和狂暴或 沉郁等神 經(jīng)癥狀，流行期中不難作出診斷。但是必須與其它的病毒性、細菌性和中毒性腦炎相鑒別。 由于母豬可能發(fā)生流產(chǎn)，公豬可能發(fā)生睪丸炎，還需注意與布氏桿菌病、細小病毒病以及生 殖和呼吸道綜合癥等鑒別。為了確診，必須進(jìn)行病毒分離和血清學(xué)試驗等特異性診斷。�ァ�

　(1) 病毒的分離和鑒定：在動(dòng)物發(fā)熱初期，可采血液或血清分離病毒。動(dòng)物死后， 應盡快(夏天不得超過(guò)2～3小時(shí))采取腦組織分離病毒。各項操作以 及病料的運送，必須遵守“冷藏”和“快速”兩個(gè)原則。根據作者等的經(jīng)驗，如將乳 鼠帶到現場(chǎng)接種，可以明顯提高病毒分離率。�ァ　∪槭笫菓�用最多的實(shí)驗動(dòng)物，也是多年來(lái)實(shí)踐證明比較有效的病毒分離動(dòng)物。 應用腦內�财は峦瑫r(shí)接種法或在腦內接種的同時(shí)，再較大量地作腹腔接種，例如0��2～0�� 5ml，�？商岣卟《痉蛛x率。乳鼠發(fā)病時(shí)，離群、拒食、抽筋、消瘦， 此時(shí)即可采腦作 進(jìn)一步傳代或鑒定。但需注意，發(fā)病乳鼠常被母鼠吃掉，故應及時(shí)將母鼠取走。也可將上述材料接種于7～9日齡的雞胚卵黃囊內，2～3天后收獲胚體，再作乳鼠接 種。  近年來(lái)常用倉鼠腎原代細胞分離乙腦病毒，即在已經(jīng)長(cháng)成單層的倉鼠腎細胞內 加入該培養瓶(管)原營(yíng)養液量1/5～1/10的接種材料，吸附30～60分鐘后，加入維持液， 繼續置37℃，每天觀(guān)察1次，共7天，如發(fā)現“＋＋”的細胞病變，即可收獲，供傳代或鑒 定用。倉鼠腎BHK��21細胞系也可被用于分離病毒，接種病料后觀(guān)察1周后如無(wú)CPE出現,可作盲傳。�ァ　〖词贡粰z材料中含有病毒，但在初代接種小鼠或細胞培養物后，往往不見(jiàn)發(fā)病或 不出現細胞病變，這是野外毒株尚未適應實(shí)驗動(dòng)物或細胞培養物的緣故。 因此第1代接 種呈陰性結果時(shí)，應繼續盲傳2～3代，也就是經(jīng)一定時(shí)間(7～10天) 而尚未發(fā)現動(dòng)物發(fā) 病或細胞出現病變時(shí)，可按常法撲殺幾個(gè)動(dòng)物采腦，或選取幾瓶細胞培養物作凍融處理， 再作下一代動(dòng)物或細胞培養物的傳代接種。�ァ　∮�由蚊體分離病毒時(shí)，用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室內飼養2～3天，待胃血 消化，抗體消失,這樣可以提高病毒分離率。分離時(shí)用氯仿將蚊熏死，鑒定分類(lèi)，并以 25、50或100只為1批，裝入滅菌的小瓶或試管中。隨后加入2～3ml25%酒精生理鹽水，  充分搖洗5～10分鐘，倒掉酒精液，再用滅菌生理鹽水或Hanks液洗2～3次后，移入玻璃 研磨器內，加入1～2ml0��5%乳白蛋白水解物或其它稀釋液，磨細后移入離心管，以3 00 0r/min轉的速度離心沉淀20分鐘，吸取上清液，如上加入青、鏈霉素，置4℃感作1小時(shí) 后接種動(dòng)物或細胞。細胞營(yíng)養液內應加兩性霉素，以免霉菌生長(cháng)。 Hsu等在臺灣南部 收集豬場(chǎng)的蚊，自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000只，分為1 650批，做成乳劑后 分別接種乳鼠和庫蚊細胞培養物。在庫蚊細胞培養物中分離到68株乙腦病毒，由乳 鼠腦分離到48株病毒，似乎說(shuō)明庫蚊細胞培養物比乳鼠更適于由蚊體分離乙腦病毒。�バ路蛛x病毒的初步鑒定按一般方法進(jìn)行，請參閱本書(shū)第十四章。隨后再用乙腦標準 毒株和標準免疫血清與新分離病毒進(jìn)行交叉補體結合試驗、交叉中和試驗、交叉血凝抑 制試驗。也可應用小鼠進(jìn)行交叉保護試驗，即用新分離毒株和標準乙腦毒株分別制備 福爾馬林滅活疫苗，給3周齡小鼠皮下接種0��1～0��2ml，共2次，間隔7天， 另留部 分小鼠不免疫作為對照。于第2次注射后兩周，用不同稀釋度的標準乙腦毒株攻擊：采用腹 腔攻擊、腦內刺激法，即在腹腔注射病毒的同時(shí)，給每只小鼠腦內注射0��03ml 生理鹽水或肉湯。觀(guān)察3周，記錄各組小鼠的死亡和保護數。如為同種病毒， 則其抵 抗標準乙腦毒株的攻擊量可比對照組高100～1 000倍， 并與以標準乙腦毒株免疫的小鼠 組的保護率相近。�ァ　�檢出病畜體內的病毒抗原，是快速診斷的需要，也是國內外正在探索和深入研究的 一個(gè)課題。作者等應用固相和液相補體結合試驗、免疫粘附試驗、反向間接血凝試驗、 熒光抗體技術(shù)、免疫酶技術(shù)、��1��2��5I放射免疫測定以及反轉錄�捕嗑勖告淩T�睵CR反應 等方法檢測乙腦感染小鼠和自 然感染病馬腦內的病毒抗原，都有較高的特異性和檢出率。��