流行性乙型腦炎病毒(三)
7.免疫乙腦病毒產(chǎn)生堅強的持久免疫力，迄今沒(méi)有見(jiàn)到臨床病例在痊愈后第二 次感染發(fā)病 的報道。且如上述，乙腦病毒的抗原變異不顯著(zhù)，尚未發(fā)現在免疫保護力方面明顯不同 的型或亞型，這就為流行性乙型腦炎的特異性預防提供了良好的基礎。目前應用的乙腦 疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種。滅活疫苗的制造方法簡(jiǎn)單，易于保存，而且安全，但 因注射劑量較大，而且經(jīng)常需要重復注射，國內目前應用的動(dòng)物乙腦疫苗以弱毒疫苗為 主，但人用乙腦疫苗主要是滅活疫苗。
(1) 滅活疫苗：1943年，美國Sabin創(chuàng )制鼠腦滅活疫苗。 我國和日本也生產(chǎn)過(guò)大批 鼠腦滅活疫苗，并對人群進(jìn)行大規模的免疫注射。由于疫苗中的鼠腦組織經(jīng)常引起過(guò)敏 反應，日本于1966年研究成功酒精和魚(yú)精蛋白純化疫苗。美國于1966年創(chuàng )制倉鼠腎組織 培養滅活疫苗,免疫效果較好，而且適于大量生產(chǎn)，故已幾乎全部取代了鼠腦滅活疫苗。 只在不具備組織培養條件的少數地區，繼續沿用鼠腦滅活疫苗作動(dòng)物的預防注射。
�、� 鼠腦滅活疫苗：采用免疫原性良好的強毒株，腦內通過(guò)8～12g小鼠， 使其最小 致死量提高至10-7/003ml(腦內)以上，作為種毒。制苗時(shí)，取種毒腦內接種小鼠 ，每只003ml。逐日觀(guān)察，一般于接種后第3～4天出現癥狀，挑選癥狀明顯和瀕死的小鼠 ，斷頸或心臟放血后無(wú)菌采腦，置于內盛玻珠的厚壁玻瓶或于電動(dòng)組織搗碎器內充分乳化 ，并補加pH78～80的磷酸鹽緩沖鹽水，作成10%懸液。再置2 000r/min的離心機內 離心沉淀20分鐘，吸取上層液，加入10%福爾馬林，使其最后濃度為02%。置4℃冰箱內， 每天充分振蕩一次，滅活21天。再用pH78～80的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋1倍， 使鼠腦的 最后濃度為5%，福爾馬林的最后濃度為01%。作者所在的實(shí)驗室曾用這個(gè)方法制造乙腦 滅活疫苗,在用小鼠作效力測定時(shí)免疫指數(保護指數)高達20萬(wàn)以上。這種疫苗用于 馬騾時(shí)，每次皮下注射5ml，間隔7～10天后再作第2次注射。 一般可使接種馬騾安全渡 過(guò)一個(gè)乙腦流行期。據幾個(gè)地區的應用結果來(lái)看，注射鼠腦滅活疫苗后可將發(fā)病率降低 至1/3～1/5。制造酒精魚(yú)精蛋白純化疫苗時(shí)，先將發(fā)病鼠腦作成20%懸液，以3 500r/min的速度 于4℃離心沉淀30分鐘，棄沉淀，吸取上層液，加入等量4℃的40%酒精，置10～15℃3小時(shí) ，再以3 500r/min的速度離心沉淀30分鐘，棄上層液，取沉淀物，加入4℃ PBS， 作成40 %懸液，再以3 500r/min的速度于4℃離心沉淀30分鐘，棄沉淀，吸取上層液，加入等量 4℃ PBS，并按每ml 2～3mg的量加入硫酸魚(yú)精蛋白，置4℃感作30分鐘后，以3 500r/mi n的速度于4℃離心沉淀30分鐘，棄沉淀物，吸取上層液，加入福爾馬林和硫柳汞，使其 最后濃度為01%和001%。再作適當稀釋?zhuān)⒓尤?05%吐溫80即成。
�、� 雞胚滅活疫苗：先使種毒通過(guò)雞胚幾代，待其完全適應于雞胚內增殖后應用。 將 雞胚適應毒作1∶100～1∶1 000稀釋后，接種于8日齡雞胚的卵黃囊內，于35～36℃溫箱中 繼續孵育64～68小時(shí)后收獲胚體，去頭及爪，加入pH78～80的磷酸鹽緩沖鹽水，于組 織搗碎器內作成20%懸液，以2 000r/min的速度于4℃滅活處理21天，經(jīng)無(wú)菌、安全和效 力檢驗后應用。馬騾每次皮下注射10ml，間隔7～10天后再作第2次注射。由于雞胚苗的 免疫效果較差，用量大，保存期短，多次注射后曾見(jiàn)少數馬匹發(fā)生過(guò)敏反應，目前已少用.
③ 倉鼠腎組織培養滅活疫苗：接種強毒于倉鼠腎組織培養細胞內， 約于接毒后30～40 小時(shí)，在出現“++”的細胞病變時(shí)收獲，加入01%～02%福爾馬林作滅活處理，即為滅 活疫苗。為了提高疫苗產(chǎn)量，生物制品單位目前通用轉瓶培養法，即在10 000～15 000 ml的大轉瓶?jì)�，接常規方法培養倉鼠腎細胞，以?xún)群?%犢牛血清的02%乳白蛋白水解物 作為營(yíng)養液，轉瓶培養。待其長(cháng)成單層后，以Earle液沖洗多次， 除去殘留的血清蛋 白，隨后換入內含007%半胱氨酸和01%人白蛋白的Earle液作維持液。維持液中含有 10-5濃度的強毒鼠腦。每瓶加入量為3 000ml。37℃培養28小時(shí)，鏡檢發(fā)現開(kāi)始有細胞 病 變時(shí)即可收毒——吸取上層液。毒力效價(jià)一般可達10-6個(gè)小鼠MLD。加入005%福爾 馬林和0005%硫柳汞，置22℃滅活8天即成。在殘留有細胞的大轉瓶?jì)�，再行加�? 000ml 維持液，繼續培養17～20小時(shí)，有時(shí)還可獲得10-5～10-6效價(jià)的病毒液。
(2) 弱毒疫苗：我國病毒學(xué)工作者在乙腦病毒的減毒和弱毒株的培育方面，做了大量 工作，并已取得可喜成果。先后育成許多弱毒疫苗株，其中某些株已經(jīng)做過(guò)大量人群或 動(dòng)物的免疫試驗。美國和日本也曾育成幾個(gè)弱毒株，例如美國應用倉鼠腎組織培養細胞 進(jìn)行繼代減毒，獲得OCT541株，再經(jīng)雞胚細胞和雞腦細胞傳代，育成高度減毒株。 日 本也用倉鼠腎細胞傳代的方法獲得幾個(gè)弱毒株。
① 53株：系我國乙腦強毒SA14株經(jīng)馴化篩選后獲得的弱毒疫苗株。SA14株 在連續通 過(guò)倉鼠腎原代細胞20代后，毒力發(fā)生顯著(zhù)變化，其對小鼠的腦內毒力已由10-5～10 -6下降至10-1～1025/003ml。經(jīng)蝕斑純化后育成1217號蝕斑株，繼續 傳代減 毒、 純 化，又選出1株蝕斑毒，即97株,再經(jīng)傳代篩選，育成53株。用此株給3周齡小鼠作皮 下注射，病毒不能入腦，但對25周齡以下的小鼠，還有一定的入腦能力。 皮下或腦 內注射1～3日齡乳鼠，均有致病力。腦內及皮下注射時(shí)的致死毒力(LD50)分別為3 0 對數以下和20對數以下。曾經(jīng)試用于40多萬(wàn)兒童的接種試驗，證明安全， 并有較好的免 疫效果，人群保護率達80～90%，抗體陽(yáng)轉率為85～91%。將53株或97株試用于馬匹和 豬的免疫接種，也獲較好效果。目前通用的是其倉鼠腎組織培養弱毒疫苗。 由于53株和97株在小鼠腦內連續傳3～5代后，殘余毒力并不明顯回升。某些地 區試用此株接種(腦內)乳鼠，待其發(fā)病后，采腦作成10%懸液， 直接供馬騾或豬的 現場(chǎng)應用，收到較好效果。
�、凇�28株：系將上述1217株經(jīng)紫外線(xiàn)進(jìn)一步減毒，再經(jīng)乳鼠皮下傳代，提高其皮 下增殖力和免疫原性而育成的弱毒疫苗株。此株在給乳鼠作腦內注射時(shí)，死亡率為75%， 皮下注射時(shí)引起50%的死亡率。3周齡小鼠在腦內注射時(shí)基本上不死亡，皮下注射后病 毒不能入腦。經(jīng)乳鼠腦內連續傳代，毒力回升不明顯。給小鼠作一次皮下免疫注射， 保護力可達70對數以上。大規模的馬群免疫試驗(13萬(wàn)余匹)證明安全。免疫后1個(gè)月， 中和抗體的陽(yáng)轉率達85%左右。流行病學(xué)調查證明，疫苗注射組的發(fā)病率為23/10萬(wàn)，而 未注射對照組的發(fā)病率為1721/10萬(wàn)，保護率為867%。目前通用倉鼠腎細胞培養疫苗。 試用28株接種小鼠，待其發(fā)病后采腦制苗，注射馬騾和豬，也取得良好的免疫效果。 曾用鼠腦和倉鼠腎培養的28株給4萬(wàn)多匹馬進(jìn)行免疫注射， 僅極少數發(fā)生輕度局部 腫脹、低燒和食欲減退，未見(jiàn)其它不良反應。 敖堅等應用另一弱毒蝕斑株——142株在BHK21細胞上制造弱毒疫苗。用 以給妊娠母豬進(jìn)行免疫注射，未見(jiàn)不良反應。接種后的中和抗體陽(yáng)轉率為80%～100%，死 產(chǎn)率顯著(zhù)下降。 在上述弱毒疫苗株的基礎上，又曾育成一些新的弱毒株，例如將53株通過(guò)雞胚、 倉鼠腎細胞交替傳代3次， 再在雞胚細胞上挑斑( 蝕斑)， 育成所謂的雞53株等等。 由于液體活疫苗在4℃的有效期僅2～3個(gè)月， 而凍干保存時(shí)又易在干燥過(guò)程中使疫苗效價(jià)下 降，因此必須積極研究弱毒疫苗的保存方法，以利推廣應用。 幼畜可由初乳獲得被動(dòng)免疫——母源抗體。具有被動(dòng)免疫的幼畜，在用弱毒疫苗接種 后不易產(chǎn)生主動(dòng)免疫。為保證有效免疫力的產(chǎn)生，活疫苗接種應在幼駒出生后2～4個(gè)月進(jìn) 行，幼豬也應在出生后2個(gè)月以上開(kāi)始接種。 日本曾用井上等育成的減毒M株于豬的預防接種。
(3) 基因工程疫苗： Konishi等在1994年以禽痘病毒作為載體分別表達了JEV的preM、E和NS1基因以及 pre M和E基因；重組病毒免疫小鼠，能抵抗致死劑量JEV的攻擊。 Konishi等于1992年在一 個(gè)高度致弱的痘苗病毒株NYVAC表達了JEV的preM、E和NS1基因， 以108PFU的重組病毒 免疫豬，7天后血清中出現JEV中和抗體及血凝抑制抗體，28天后注射第二個(gè)劑量的重組病毒 , 血清中和抗體效價(jià)增高。在用2×105PFU JEV攻擊后， 已接種重組病毒的豬血清中JEV水 平顯著(zhù)降低�；钶d體疫苗與常規疫苗相比,有著(zhù)一定的優(yōu)勢，有望代替常規疫苗的應用。
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