5.增殖所有甲病毒均有相似的生物學(xué)特性。病毒在蚊等節肢昆蟲(chóng)中的增殖是其在自然界得以生存的一個(gè)重要環(huán)節。然而，在脊椎動(dòng)物宿主體內的增殖對病毒在自然界中的生存卻是不必需的。蚊是甲病毒的原始宿主。雌蚊叮咬受感染的脊椎動(dòng)物宿主后，吸食的感染性血液積貯在蚊中腸的后部，這一段中腸由基底層環(huán)繞的單層上皮細胞組成。血液中的病毒首先感染這些細胞，隨后，病毒越過(guò)腸管進(jìn)一步感染血淋巴和神經(jīng)系統，其后造成唾液腺的感染，這時(shí)蚊唾液中含有病毒，此時(shí)叮咬易感脊椎動(dòng)物即可將病毒傳給后者。病毒進(jìn)入蚊細胞后，造成非溶細胞性感染，所以細胞不出現病變，成為慢性感染，使病毒在蚊體內長(cháng)期生存下去。蚊也不因感染而發(fā)病，一但感染，將終身帶毒。從蚊吸食感染性血液到蚊唾液中有病毒分泌這段時(shí)間一般為3天至2周，甚至更長(cháng)，這取決于病毒的感染量、環(huán)境溫度以及媒介昆蟲(chóng)的種類(lèi)。一般來(lái)說(shuō)，每種昆蟲(chóng)媒介對病毒的易感性是不同的，脊椎動(dòng)物血液中的病毒必須達到一定濃度才能造成昆蟲(chóng)媒介感染，使病毒進(jìn)一步傳播，這一濃度稱(chēng)為感染閾(thresholddose)，不同昆蟲(chóng)媒介具有不同的感染閾。甲病毒可在許多哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的組織培養細胞中增殖。實(shí)驗室主要應用雞胚或鴨胚原代細胞、倉鼠腎原代細胞和BHK21細胞以及綠猴腎細胞(Vero或BSC1)等作為增殖和研究這類(lèi)病毒的宿主細胞。甲病毒可在蚊細胞內良好增殖，但是其增殖動(dòng)態(tài)與在脊椎動(dòng)物細胞中的顯著(zhù)不同。初次感染時(shí)，甲病毒在蚊細胞內的產(chǎn)量可與脊椎動(dòng)物細胞中的相比。病毒在脊椎動(dòng)物細胞內可引起細胞病變，而在蚊細胞一般不產(chǎn)生細胞病變。蚊細胞在感染病毒后常發(fā)展為慢性感染，此時(shí)細胞可以繼續正常地生長(cháng)和增殖。這種帶毒傳代狀態(tài)可以維持好幾個(gè)月，許多病毒世代。不過(guò)細胞的產(chǎn)毒量此時(shí)明顯降低，就SINV來(lái)說(shuō)，每個(gè)蚊細胞每天只能產(chǎn)生1～5個(gè)蝕斑形成單位的病毒,而在脊椎動(dòng)物，每個(gè)細胞每小時(shí)可產(chǎn)生2000個(gè)蝕斑形成單位的病毒。為什么甲病毒在脊椎動(dòng)物培養細胞中引起明顯的細胞病變，導致宿主細胞RNA和蛋白質(zhì)合成迅速受阻,病毒產(chǎn)量極高，而在節肢昆蟲(chóng)細胞中卻常常發(fā)生慢性持續性感染，病毒產(chǎn)量很低呢?一般認為，這與病毒在兩種細胞中不同的成熟過(guò)程有關(guān)。在脊椎動(dòng)物細胞中，衣殼蛋白與病毒RNA在胞漿內裝配成核衣殼，在胞漿膜包上含有病毒糖蛋白的宿主細胞雙層內質(zhì)膜而成熟，然后從細胞膜出芽釋放。而在節肢昆蟲(chóng)細胞中，病毒粒子的裝配完全在胞漿內由膜樣物包圍的囊泡中進(jìn)行，囊泡內含有核心蛋白和來(lái)自高爾基體的膜樣結構。當病毒粒子成熟時(shí)，整個(gè)囊泡與宿主細胞膜相融合，囊泡中的病毒粒子即被釋放于細胞外液中。病毒在細胞內的裝配與成熟似乎是在完全隔離的狀態(tài)下進(jìn)行的，因此細胞功能不受影響。病毒增殖開(kāi)始于病毒與細胞表面特異受體的結合。每平方微米的雞胚成纖維細胞和倉鼠腎細胞的表面可以吸附20～200個(gè)SINV粒子，也就是每個(gè)細胞可以吸附105個(gè)病毒粒子。吸附以后，病毒核衣殼因病毒囊膜與細胞胞漿膜融合而侵入胞漿內，也可借助細胞的胞飲作用進(jìn)入細胞。隨即發(fā)生病毒RNA的復制與轉錄，在RNA轉錄后由26SRNA翻譯出結構蛋白質(zhì)。甲病毒的成熟包括以下幾個(gè)步驟:①在細胞胞漿膜上出現病毒糖蛋白；②病毒核衣殼與已被改變了性質(zhì)的胞漿膜的內面結合；③核衣殼通過(guò)已經(jīng)改變了性質(zhì)的細胞表面出芽。
6.抗原性甲病毒各成員的核心蛋白有非常相近的抗原性，在熒光抗體染色、ELISA、放免檢測和補體結合試驗等血清學(xué)反應中常出現交叉反應現象。而甲病毒的囊膜糖蛋白的抗原性卻有明顯的差異,這是鑒定甲病毒種類(lèi)及其亞型的分子基礎，通常采用中和試驗和改良的血凝抑制試驗加以鑒別。如采用動(dòng)態(tài)血凝抑制試驗可以容易地區分委內瑞拉馬腦炎病毒的亞型，也可以鑒別不同地理位置的東方型馬腦炎病毒毒株。病毒的血凝活性主要與囊膜糖蛋白E1有關(guān)，中和反應主要與E2有關(guān)。甲病毒成員間的氨基酸序列同源性，在變異較大的結構蛋白約40%；在非結構蛋白約60%。甲病毒與風(fēng)疹病毒沒(méi)有血清學(xué)上的交叉關(guān)系，序列分析沒(méi)有發(fā)現二者的結構蛋白有相似的氨基酸序列。甲病毒具有凝集鵝、鴿和新生雛雞紅細胞的能力，但血凝素易于失效，且血凝反應發(fā)生在較窄的pH范圍內。因此，控制和保證一定的pH以及防止病毒抗原失效，是進(jìn)行這類(lèi)病毒血凝反應的主要條件。必須指出，交叉反應的程度，不僅與免疫血清的種類(lèi)、效價(jià)及其制造方法有關(guān)，而且與毒株本身和試驗條件有關(guān)。
7.抵抗力稀釋的福爾馬林(0.2%～0.4%)、紫外線(xiàn)和60℃加熱，均可在短時(shí)間內使病毒滅活。由于有囊膜，故甲病毒對乙醚、氯仿等脂溶劑敏感。甲病毒對胰酶有抵抗力。丙酮似乎只能破壞病毒外膜，核衣殼幾乎不受影響。因此，應用蔗糖丙酮法制備的血凝素抗原通常依然具有感染性。冷凍干燥是最理想的病毒保存方法，病毒活力可以維持5～10年以上。迅速冷凍，并保存在-70℃，也是保存病毒的良好方法。50%的甘油緩沖鹽水有較好的保存作用，如置普通冰箱的小冰匣內(-10℃)，病毒可保持活力3～6個(gè)月。新鮮的感染組織(如鼠腦)保存在-10℃溫度中，最好不超過(guò)一個(gè)月。病毒對酸敏感，所以實(shí)驗室內常用1%鹽酸溶液作為玻璃或塑料器材的消毒液。病毒在pH8～9的環(huán)境中最為穩定，病毒懸液和組織培養液中的蛋白質(zhì)對病毒具有良好的保護作用。故在配制病毒懸液時(shí)一般應用pH8.0以上的緩沖液或再加入脫脂牛奶、滅活兔血清或白蛋白作為保護劑。
8.病毒進(jìn)化對一些甲病毒進(jìn)行的核苷酸序列測定、氨基酸序列比較和系統樹(shù)(phylogenetictree)分析表明，甲病毒是從一個(gè)共同的病毒祖先進(jìn)化而來(lái)。這一病毒祖先存在于數千年前，可能是一種昆蟲(chóng)病毒。甲病毒在自然界中的進(jìn)化速度比較緩慢,如西方型馬腦炎病毒(WEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)和蓋他病毒在一定的地理環(huán)境中，它們的遺傳特性在較長(cháng)一段時(shí)間內是穩定的。序列分析表明，東方型馬腦炎病毒(EEEV)北美毒株的結構蛋白基因序列在1933～1955年的22年中是相當保守的，同樣，寡核苷酸指紋圖分析表明EEEV的基因組RNA也高度保守，這些結果說(shuō)明EEEV的進(jìn)化速度也是很慢的。在進(jìn)化過(guò)程中，EEEV分化為3個(gè)單譜系群(monophyleticgroup):北美群包括北美及加勒比分離的所有毒株;南美群包括巴西和秘魯分離的毒株;阿根延巴拿馬南美群包括阿根廷、圭亞那、厄瓜多爾、巴拿馬、特立尼達和委內瑞拉分離的毒株。北美群的進(jìn)化率約為每年每個(gè)核苷酸替換16×10-4次，阿根廷巴拿馬南美群的進(jìn)化率約為每年每個(gè)核苷酸替換4.3×10-4次。北美和南美群大約分化于1000年前，而2個(gè)南美群大約分化于450年前。在上千年的進(jìn)化過(guò)程中，一種類(lèi)似甲病毒的病毒祖先從舊大陸引入到新大陸或從新大陸引入到舊大陸，從而產(chǎn)生2個(gè)甲病毒群，一群為新大陸病毒(NewWorldviruses)，包括EEEV、WEEV和VEEV；另一群為舊大陸病毒(OldWorldviruses)，包括SINV、米德?tīng)柋げ《?Middelbergvirus,MIDV)、ONNV、RRV和SFV。
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