輪狀病毒屬 7. 診斷由于人和動(dòng)物的輪狀病毒感染極為普遍，而動(dòng)物的臨床發(fā)病及其血清中的抗體 效價(jià)又無(wú)明顯的線(xiàn)性平行關(guān)系，因此，抗體測定在輪狀病毒感染的現癥診斷上 的價(jià)值不大，只能說(shuō)明感染率。即使應用雙份血清亦然。有謂血清中IgM的含量 與感染的關(guān)系比較密切，IgM測定可能具有較大的現癥診斷意義。病畜在腹瀉時(shí)隨糞排出大量病毒，每克排泄物中有時(shí)含有高達109～10個(gè)病毒粒子。因此可用糞濾液接種敏感的組織培養細胞來(lái)分離病毒。如果撲殺1頭典型 病畜，采取小腸后段的腸內容物作病毒分離，效果更好。由于排泄物或腸內容物 中的病毒含量較高，也為病毒粒子或病毒抗原的直接檢出提供了可能性。
（1）電鏡觀(guān)察 采取腹瀉糞汁或后段小腸內容物10ml，用015mol/L pH76磷酸鹽緩 沖鹽水作1∶4稀釋?zhuān)瑑A入盛有玻璃珠的滅菌玻瓶中，充分振蕩30分鐘。吸取懸液， 以3 000r/min離心沉淀20分鐘，除去粗大的纖維和顆粒。吸取上清液，再以10 000r/min 離心沉淀30分鐘。將上清液用滅菌G6號玻璃濾器或孔徑為022μm的濾膜過(guò)濾， 再以38 000r/min超速離心沉淀90分鐘。傾棄上清液，將沉淀物研磨或用超聲波處理， 懸浮于幾滴蒸餾水中，并滴加于銅網(wǎng)上，用磷鎢酸負染后鏡檢。根據輪狀病毒的特 征性形態(tài)進(jìn)行識別。也可將病料標本置-20℃凍融處理，加入等量蒸餾水，如上充分振蕩混勻，用粗銅 網(wǎng)初濾后作為懸液。于1份懸液中加入1份三氯三氟乙烷（CCl2FCClF2）， 振蕩混合30分鐘，或置組織搗碎器中高速處理2×2分鐘（10 000r/min）。收集混合 懸液，以3 000r/min離心沉淀20分鐘，吸取上清液，再用10 000r/min離心沉淀30分鐘，并 以G6號玻璃濾器或孔徑為02２μm的濾膜過(guò)濾。收集濾液，以38 000r/min離心沉淀90 分鐘，如上滴加于銅網(wǎng)上，負染后鏡檢。據Fleweett報道，每毫升糞汁標本中含有105個(gè)病毒粒子時(shí)，仔細 觀(guān)察可能看到病毒粒子；每毫升標本內含106個(gè)病毒粒子時(shí)，一般都能獲得陽(yáng) 性電鏡結果；每毫升標本中的病毒粒子超過(guò)108個(gè)時(shí)，那就極易作出診斷。如果糞汁標本中的病毒粒子太少，電鏡難以檢出，可將上述已經(jīng)初步濃縮提純并 準備滴加于銅網(wǎng)的病毒懸液，再用密度梯度離心沉淀法進(jìn)一步濃縮。先在離心沉 淀管內加入氯化銫溶液作墊，并在其上層加10%～30%蔗糖溶液，最上層加病毒懸液， 離心沉淀后吸取氯化銫墊表面的濃縮病毒液，滴加于銅網(wǎng)上，如上負染和鏡檢。 有關(guān)密度梯度離心沉淀和電鏡技術(shù)的具體方法，請參考本書(shū)第十二章和第十三章。一個(gè)更為簡(jiǎn)單但敏感性較差的電鏡檢查方法，已經(jīng)成功地用于糞便中輪狀病毒的 檢出。先將腹瀉糞汁作3 000r/min離心沉淀30分鐘，吸取上清液，加入等量氯仿，充 分振蕩混合，再次3 000r/min離心沉淀30分鐘，吸取上清液，直接滴加于銅網(wǎng)上，負染 后鏡檢。有謂病料中的呼腸孤病毒和輪狀病毒的形態(tài)相似，電鏡下不易區別。根據我們經(jīng) 驗，兩者在形態(tài)結構上并不完全相同，仔細觀(guān)察不難加以區別：①輪狀病毒的內 衣殼的殼粒為棍棒狀，向外呈輻射狀排列，構成內衣殼，外周為一層由光滑薄膜構 成的外衣殼，故而病毒表面光滑；相反，呼腸孤病毒內衣殼的殼粒接近球形或呈短 棱柱狀，外衣殼的殼粒清楚可見(jiàn)，故整個(gè)病毒的表面呈粗糙顆粒狀；② 輪狀病毒的核心較小，直徑為３７～４０nm，而呼腸孤病毒的核心較大， 直徑為４０～４５nm。
（２）免疫電鏡觀(guān)察 先行制備免疫血清，即以上述提純的輪狀病毒，加入 等量弗氏不完全佐劑后，多次肌肉注射家兔或豚鼠，并于末次注射后一個(gè)月采 血，析得血清。也可應用病畜、禽恢復期血清。必要時(shí)可用幾個(gè)動(dòng)物的混合血 清。在糞濾液中加入免疫血清，使病毒粒子與抗體結合而發(fā)生凝集，電鏡檢查可見(jiàn) 成堆的病毒粒子。具體方法是在１份糞濾液內加入４份１∶５０稀釋?zhuān)ㄒ暱贵w 效價(jià)的高低可適當調整）的免疫血清或恢復期血清。稀釋血清需先用Ｇ６號 玻璃濾器或孔徑為０２2μm的濾膜過(guò)濾。振蕩混合后置３７℃感作３０～６０ 分鐘，再置４℃過(guò)夜。翌晨以１０ ０００ｒ/min離心沉淀３０分鐘。傾棄上清 液，將沉淀物如上懸浮于幾滴蒸餾水或管壁殘留液中，隨后滴加于銅網(wǎng)上進(jìn)行 負染和鏡檢。陽(yáng)性標本中通常具有較多的成堆病毒粒子。如果病毒粒子破損， 則應考慮進(jìn)一步提高免疫血清的稀釋度或者縮短其感作時(shí)間。也可先用抗輪狀病毒免疫血清或恢復期血清（以豬為例）如上進(jìn)行感作處理，離 心沉淀后將沉淀物重新懸浮于少量（05～1ml）兔抗豬IgG內，如上感作、離 心沉淀、滴樣和鏡檢。
（3）特異性熒光細胞檢出 將腹瀉糞汁適當稀釋后，于載玻片上作成涂片。３７℃干燥２０分鐘后，用冷丙酮固定１０分鐘，隨后用熒光素標記的特異抗 體（IgG）于室溫下染色３０分鐘，徹底沖洗后，置熒光顯微鏡下檢查熒光細胞 �；蛘呦扔猛每馆啝畈《究贵w感作處理，隨后再用熒光素標記的抗兔IgG進(jìn)行間 接法染色。如果撲殺１頭典型病豬（犢牛），刮取空腸和回腸的柱狀上皮制作涂片，更 易檢出大量熒光細胞。在實(shí)驗感染動(dòng)物，通常在接種后４小時(shí)即可在小腸粘膜 上皮細胞內看到病毒抗原，最大量的感染細胞出現于接種后１６～２４小時(shí) 。此后減少，接種后１８０～３４０小時(shí)就很難找到陽(yáng)性熒光細胞。
（４）病毒分離 以豬的輪狀病毒為例。如上制備糞濾液，加胰蛋白酶處 理后，接種已經(jīng)長(cháng)成單層的ＭＡ１０４細胞和豬腎ＰＫ１５細胞。生長(cháng)液為 內含05%乳白蛋白水解物和１０％犢牛血清的ＥＭＥＭ。傾棄營(yíng)養液后，種 入糞濾液，３７℃感作吸附１小時(shí)，吸棄接種物，換入不含血清的維持 液。３７℃孵育１８～２４小時(shí)，即可應用直接或間接法熒光抗體檢出熒光細 胞�；蛟诮臃N后４８～７２小時(shí)收獲培養物，經(jīng)超聲波和胰蛋白 酶處理后接種已經(jīng)沖洗的新的單層細胞，３７℃吸附１小時(shí)后，吸棄接種物， 再如上換入不含血清的維持液。維持液內也應加入胰蛋白酶。
（５）放射免疫測定 Middleton等應用放射免疫夾心間 接法直接檢測糞標本中的輪狀病毒抗原。敏感性比電鏡檢查病毒粒子高１０倍 以上，且已成功地用于臨床標本。先用兔抗輪狀病毒抗體包被聚苯乙烯小管，隨 后加入５×稀釋糞汁在離心沉淀后吸取的上清液，沖洗后加入豚鼠抗輪狀 病毒抗體，感作并沖洗后，最后加入125Ｉ標記的兔抗豚鼠抗體。詳細方法 見(jiàn)本書(shū)第十四章。
（６）ELISA測定 原理與上述放射免疫測定相同，僅以辣根過(guò)氧化物酶標記 抗體代替125I標記抗體，并經(jīng)底物顯色后進(jìn)行判定。具體方法請見(jiàn)本書(shū)第 十四章。ELISA試驗是一種敏感而特異的試驗，使用范圍廣。商品化試劑盒 通常檢查Ａ群輪狀病毒。
（７）包被紅細胞固相凝集試驗 本法已經(jīng)成功地用于糞便中輪狀病毒的檢 測。先用抗輪狀病毒抗體包被聚苯乙烯Ｕ型微量滴定板的孔，洗滌后加入以Ｐ ＢＳ１０×稀釋的待檢糞便，37℃感作１小時(shí)，反復洗滌后，加入氯化鉻 交聯(lián)的抗輪狀病毒抗體包被的綿羊紅細胞，并按常規血凝試驗的判定方法進(jìn)行 判定，請參閱本書(shū)第十四章�，F在用乳膠顆粒代替紅細胞制作的乳膠凝集商品 化試劑盒，直接用于檢查輪狀病毒，這種方法是特異且比電鏡敏感的快速診斷 方法，能診斷出臨床感染。
（８）中和試驗 主要用于鑒別輪狀病毒的種屬特異性，也就是識別其動(dòng) 物來(lái)源。通常是在微量培養板上培養ＰＫ１５細胞、ＭＡ１０４細胞或猴腎 傳代ＬＬＣ ＭＫ2細胞。每孔02ml，內含5×104個(gè)細胞。待其長(cháng)成 單層細胞后，接種不同稀釋度的糞濾液或病毒懸液，每孔５０μl。３７℃孵育２４小 時(shí)后用熒光抗體檢查熒光細胞。選擇每５０μl中含有１０4個(gè)以上熒光 細胞單位的糞濾液或病毒懸液作為抗原。正式試驗時(shí)，將糞濾液或病毒懸液稀釋至１００～２００熒光細胞單位／５ ０μl，加入等量倍比稀釋的兔抗輪狀病毒抗體，３７℃感作１小時(shí)后，分別 加入于微量培養板各孔的細胞培養物內，置３７℃孵育１８～２４小時(shí)。隨后 如上用熒光抗體染色，以能減少５０％熒光細胞的血清稀釋度為判定終點(diǎn)。血 清的稀釋倍數即其中和效價(jià)。免疫血清對同源病毒的中和效價(jià)通常比異源病毒 高４倍以上。0
（９）補體結合試驗 可用已知血清鑒定病毒，也可應用已知抗原檢測動(dòng)物 血清中的抗體。如上述，補體結合試驗只能檢出各種動(dòng)物輪狀病毒的共同抗原， 沒(méi)有鑒別病毒種屬來(lái)源的能力，故只用于輪狀病毒的初步鑒定�？乖圆⌒笄� 糞汁制備，即取腹瀉糞汁，在ＰＢＳ中作成１０～２０％（Ｖ／Ｖ）懸液， 以７ ０００r/min離心沉淀２０分鐘，吸取上清液，再以３８ ０００r/min超 速離心６０分鐘。取沉淀物懸浮于少量ＰＢＳ中即成。必要時(shí)還可用超聲波適 當處理。另以健康動(dòng)物糞便同樣處理后制成正常對照抗原。
（１０）病毒核酸電泳法 用于直接檢測輪狀病毒感染，并同時(shí)能鑒定出病 毒基因組的電泳型，是研究輪狀病毒分類(lèi)學(xué)和流行病學(xué)的最常見(jiàn)方法。通常將 病料或感染的培養物凍融處理后，經(jīng)差速離心、蔗糖密度梯度離心制備病毒樣 品后，從輪狀病毒中提�。遥危吝M(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＰＡＧＥ），銀染 ，根據病毒ＲＮＡ節段的數目及圖式即可作出判斷。血清學(xué)分析一般檢查不出 同一型輪狀病毒的微小差異，但ＰＡＧＥ法可以檢出。如果糞樣中病毒含量高，應用下述簡(jiǎn)單的核酸提取方法，也可獲得滿(mǎn)意的電泳 鑒定結果。取糞液025ml，加入Eppendorf管中，再加等量２％ＳＤＳ溶液，振 蕩混合３０秒鐘，立即加入苯酚氯仿混合液05ml，如上振蕩混合。１０ ０ ００r/min離心沉淀５分鐘，吸取上層水相，即為核酸樣品，立即進(jìn)行電泳。加 樣時(shí)，取核酸樣品２０～４０μl，加樣品稀釋液３０～６０μl，混勻后即將Eppendorf 管放入９０℃水浴加熱２分鐘，隨后滴加凝膠板。電泳電壓為３００～５００ Ｖ或用７０～１００ＭＡ電流量，電泳１小時(shí)后用１０％乙醇、０５％乙酸固 定１５分鐘，并以硝酸銀染色后觀(guān)察。
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