輪狀病毒屬（Rotavirus）[HT5K〗 同義名：雙層病毒（Duoviruses） 輪狀病毒是各種幼齡動(dòng)物非菌性腹瀉的主要病原之一。最早于1968年由 Mebus 等在美國內布拉斯加州一農場(chǎng)犢牛腹瀉病例中發(fā)現，歐、美洲各國以及澳大利亞、 新西蘭和日本等都發(fā)現了牛輪狀病毒引起的犢牛腹瀉，澳大利亞和英、美等國均報 道有輪狀病毒引起的仔豬腹瀉。此外，在綿羊、山羊、幼駒、鹿以及兔和小鼠等 也有發(fā)生輪狀病毒性腹瀉的報道。小鼠的流行性腹瀉就是輪狀病毒引起的。雞 和火雞等多種禽類(lèi)中亦有輪狀病毒感染的存在。我國亦有豬、牛、羊、犬和多種禽類(lèi)等輪 狀病毒感染的報道，并已發(fā)現或分離鑒定了病毒。輪狀病毒感染引起嚴重的經(jīng)濟損失。以英國為例，犢牛輪狀病毒性腹瀉的發(fā)病率 為60%～80%，死亡率為0%～50%，1%～4周齡仔豬群的發(fā)病率超過(guò)80%，死亡率7%～20%。輪狀病毒感染引起的腹瀉是一種世界性傳染病。據初步統計，全世界幼兒發(fā)生的腸炎至少有 50%是 由輪狀病毒引起的。該屬代表種為人輪狀病毒，其它成員包括從人、牛、小鼠（EDIM）、豚鼠、綿羊、山羊、豬 、猴（SA11）、馬、羚羊、北美野牛（Bison）、鹿、家兔、犬、禽的分離株。
[BT4]1. 形態(tài)特征病毒粒子略呈圓形，具有雙層衣殼。直徑為65～75nm。中央為一個(gè)電子致密 的六角形核心，直徑37～40nm。周?chē)@有一個(gè)電子透明層。輪狀病毒曾被描 述為類(lèi)呼腸孤病毒，但可根據它們清晰明確的光滑外緣與呼腸孤病毒相區別。殼 粒由此向外呈輻射狀排列，構成內衣殼。外周為一層由光滑薄膜構成的外衣殼， 厚約20nm，外衣殼可能是在內質(zhì)網(wǎng)膜上芽生時(shí)獲得的。以核心為轂，以呈輻射狀排列的內 衣殼為輪輻，以外衣殼為輞，構成了特征性的輪狀結構。輪狀病毒這一名稱(chēng)，就 由此而來(lái)。有關(guān)輪狀病毒的超微結構，學(xué)者們的意見(jiàn)尚不一致。曾提出過(guò)內 衣殼有３２個(gè)、１３２個(gè)、１６２個(gè)、１８０個(gè)、３２０個(gè)殼粒構成呈２０面 體排列的多種模型。Martin等（1975）認為輪狀病毒與環(huán)狀病毒一樣，也有32個(gè)大的環(huán)形殼粒，且其180個(gè)三聯(lián)亞單位 按T=9方式組成20個(gè)三角面體。每個(gè)三聯(lián)亞單位包含3個(gè)結構單位，所以一共有540 個(gè)結構單位。但據Esparza（1978）報道，輪狀病毒表面有162個(gè)孔，由320個(gè)三聯(lián) 亞單位按T=9方式組成20個(gè)三角面體。因每個(gè)三聯(lián)亞單位包含三個(gè)結構單位，所 以一共有960個(gè)結構單位。[HT5”SS][JZ]圖19-3 輪狀病毒（橫杠=100nm） [CD2]自 楊盛華[HT]出現上述不同的觀(guān)察結果，也許是標本制作方法不同的緣故�，F公認輪狀病毒為二十面體，三角剖分數T=13。Stannard等（1977）對乳鼠流行性腹瀉輪狀病毒和猴輪狀病毒SA11株進(jìn)行了 細致的電子顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現其內衣殼有180個(gè)形態(tài)亞單位，排列成晶格狀。12個(gè) 頂各為一個(gè)空隙，由5個(gè)殼粒圍繞，另外80個(gè)空隙各由6個(gè)殼粒圍繞。外衣殼由蜂 窩樣的晶格組成，且與內衣殼的晶格排列相符。 Stannard還繪制了一幅有關(guān) 輪狀病毒衣殼結構的模式圖，見(jiàn)圖1９-4。除完整的病毒粒子（稱(chēng)為光滑型，即S顆粒）外，還�？梢砸�(jiàn)到?jīng)]有外衣殼的病毒粒 子，稱(chēng)為粗糙型，即R顆粒。形成無(wú)感染性的或感染性差的單層衣殼殼粒，這種顆粒 ，比完整病毒粒子小，其出現的相 對頻率甚低，但已發(fā)生在雞、仔豬、犢牛和人類(lèi)的感染中，約占仔豬輪狀病毒感染的５％，而在牛則低至１％。此外還有空衣殼。在已感染的小 腸上皮細胞的胞漿內，常有無(wú)定形的毒漿（viroplasm）和微管樣結構（其表面形態(tài) 與病毒粒子相同），可能是病毒衣殼異常合成的產(chǎn)物。[HT5”SS][JZ]圖19-4 輪狀病毒衣殼結構模式[JY,16][CD2]自Stannard[HT][BT4]2. 理化學(xué)特性輪狀病毒粒子和核心在氯化銫密度梯度中的浮密度分別為136～138g/cm3和144g/cm3。S20w=525。病毒由11個(gè)節段的雙鏈RNA組成，大小為06×103～33×103kDa。以Nebraska株輪狀病毒為例，各節段的分子量分別 為221、185、170、155、100、082、051、051、026、0 20和020×103kDa。RNA占病毒粒子重量的12%～15%。短的保守序列全在5′末端。輪狀病毒ＲＮＡ的１１個(gè)節段，在聚丙烯酰胺凝膠電泳后，易于分開(kāi)，形成特定的電泳帶組合模 式，即電泳圖型模式，簡(jiǎn)稱(chēng)電泳型。這１１條帶分為４個(gè)區段。常見(jiàn)的動(dòng)物和 人的輪狀病毒的４個(gè)區段中，各帶的排列位置為４∶2∶3∶2，統稱(chēng)Ａ群。根據 第１０和第１１節段之間距離的長(cháng)短，又分長(cháng)型和短型。后來(lái)又發(fā)現了一些新 的輪狀病毒，其電泳型與Ａ群不同，稱(chēng)為Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｆ群，見(jiàn)表19-3和 圖19-5。[HT5”H][JZ]表19-3 輪狀病毒分群特征[HT6SS][BG(!][BHDFG2,WK6,K14,K11,K20ZQW]群 群特異性抗原 電 泳 型 [JZ]宿 主[BHDG10]ABCDEF[]ABCDEF[]4∶2∶3∶24∶2∶2∶34∶3∶2∶25∶2∶2∶24∶2∶2∶33∶3∶3∶2[]多種動(dòng)物和人豬、牛、大鼠、中國成人、小兒小兒、豬禽豬禽[BG)F][HT][HJ]盡管不同的血清型可能呈現相似的電泳型，而同一血清型又可能顯示不同的電 泳型，但國內外迄今還常應用電泳分型法作為鑒定輪狀病毒的主要手段。[HT5”SS][JZ]圖19-5 輪狀病毒RNA的電泳型[HTSS][JZ][WB]A. 常見(jiàn)輪狀病毒，長(cháng)型，4∶2∶3∶2[DW]B. 常見(jiàn)輪狀病毒，短型，4∶2∶3∶2[DW]C. 非典型輪狀病毒，5∶2∶2∶2[HT]應用聚丙烯酰胺凝膠電泳，可在不同毒株間發(fā)現RNA節段的電泳遷移圖譜有一定 程度的差異，不同種動(dòng)物的輪狀病毒之間的差異更明顯。其中最重要的是根據第10和11 節段之間距離的長(cháng)短劃分的所謂長(cháng)型與短型。一些A群輪狀病毒具有血凝性，例如牛NCDV株能凝集人O型以及豚鼠、馬、綿羊等紅細 胞。綿羊和人株能凝集雞、綿羊、兔、豚鼠及人的紅細胞。我國江蘇省的分離株能凝 集豚鼠、馬、人O型、綿羊及犢牛紅細胞。最適pH72～74，溫度為37℃，血細胞濃度 為05%。血凝和血凝抑制試驗亦可提供一種毒株分類(lèi)方法。輪狀病毒對環(huán)境因子和許多常見(jiàn)消毒劑如碘附和次氯酸鹽有較強的抵抗力，能耐 受乙醚、氯仿和去氧膽酸鈉處理而不影響其感染性。對酸（pH30）和胰酶穩定，56 ℃ 30分鐘使其感染力降低2個(gè)對數。1mol/L MgCl2 不能增高其對56℃ 60分鐘 的穩定性。糞便中的病毒在18～20℃室溫中，經(jīng)7個(gè)月仍有感染性。能耐1%甲醛1 小時(shí)以上。10％聚維酮碘（povidoneiodine）、９５％乙醇和6７％氯胺Ｔ是有效消毒劑�？偟恼f(shuō)來(lái)，蛋 白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增強輪狀病毒和正呼腸孤病毒的感染性，由于輪狀病毒 對外界環(huán)境因素及消毒劑作用有抵抗力，所以當清洗和消毒畜禽舍時(shí)必須注意到 這個(gè)特點(diǎn)。
[BT4]3. 抗原性病毒粒子表面有３種抗原，即群抗原、中和抗原及血凝素抗原。群抗原與多種 結構蛋白有關(guān)，主要是由第6節段編碼的內殼蛋白Vp6；中和抗原主要是由第9節段編碼的外殼糖蛋白Vp7；血凝素抗原是由第4節段 編碼的外殼蛋白Vp4，可被蛋白水解酶水解。不是所有的輪狀病毒都有血凝 素。根據群抗原的差異及病毒RNA末端指紋圖的分析將輪狀病毒分為A～F 6個(gè)群。絕大多數哺乳動(dòng)物輪狀病毒，具有一種相同的群抗原。這些輪狀病毒被命名為A 群或典型輪狀病毒，包括大多數哺乳動(dòng)物和禽A群輪狀病毒，是研究的主要對象。B～F群只在原代宿主上生長(cháng)，為非典型輪狀病毒或副輪狀病毒(pararotavirus），缺乏 共同抗原，其基因片段只有第5、7、9節段RNA；其中B群出現在人、豬、牛、綿羊和大鼠， 在 我國發(fā)現的成人輪狀病毒是重要代表；C群在豬，很少見(jiàn)于人，D群和F群在禽，E群在豬。禽輪狀病毒與哺乳動(dòng)物無(wú)抗原相關(guān)性。盡管用免疫熒光、ELISA、補結試驗、瓊擴等方法檢測群抗原，但同群輪狀病毒仍有不 同的抗原。此種抗原可用血清中和試驗或蝕斑減數中和試驗鑒別。根據中和抗 原Vp7的差異可將A群輪狀病毒分為14個(gè)血清型，分別用阿拉伯數字G1～11 標記；依據Vp4差異大約有８個(gè)血清型，標記為p1～8，它們間有部分抗原交叉。
[BT4]4. 培養盡管最初分離的幾個(gè)輪狀病毒株如猴的SA11株、牛的Nebraska株和O株都易在細 胞培養中增殖，但在應用胎腸器官培養以及胎腸單層細胞和胚腎等許多原代或細 胞系單層細胞培養物分離和增殖其它一些輪狀病毒時(shí)，如牛、豬和人的輪狀病毒時(shí)，都常不易成功或則增殖率不高，或則不易傳代。Banatvala等（1975）將培養有豬腎細胞的蓋玻片置于平底塑料管底，待其長(cháng) 成單層后，接種嬰兒糞濾液，并以3 000r/min離心沉淀2小時(shí)，隨后置37℃培養。24小 時(shí)后用熒光抗體染色，發(fā)現有陽(yáng)性熒光細胞，同樣培養接種，但未離心沉淀的細胞 培養物卻呈陰性結果。Bryden等（1977）和Bridger（1981）也證明離心沉淀物可以提高輪狀病毒的陽(yáng) 性分離率，但仍不能使輪狀病毒在細胞培養物中連續傳代。培養輪狀病毒使用最普遍的是MA104（恒河猴胎腎傳代細胞系），其它敏感細胞尚 有AGMK（原代非洲綠猴腎細胞）、CMK（一種猴的原代腎細胞以及CV1（非洲綠猴 腎細胞系）�；痣u和雞等禽輪狀病毒的初次分離也可用雛雞腎或雞胚肝細胞的原 代培養物。某些禽A群輪狀病毒既能夠感染未致敏的禽脾淋巴細胞。又能感染禽 淋巴母細胞轉化細胞系。連續轉動(dòng)培養有利于分離和復制輪狀病毒。為了在細胞培養中復制輪狀病毒和連續傳代，通常需要用胰蛋白酶處理激活。Clask 等（1981）建議病毒需經(jīng)10μg/ml胰酶處理和無(wú)血清培養基維持，認為這對感染是必需的。胰蛋白酶的活性受保存時(shí)間、不同的生產(chǎn)批號等因素的影響。因此，建議在接種 病毒之前，可以先測定維持液中胰蛋白酶的需要量。方法是在維持液中加入不同 濃度的胰蛋白酶（通常為05、10、15……10μg/ml），當旋轉培養中的MA104細胞 長(cháng)成單層后，不要接種病毒，而是換上加有胰蛋白酶的維持液。一般在數小時(shí)之內， 高濃度的胰蛋白酶將引起細胞單層脫壁。24小時(shí)之后，最適濃度的胰蛋白酶至少應 有50%的細胞單層未脫壁。關(guān)于胰蛋白酶促進(jìn)輪狀病毒感染性的機理，可能是由于對細胞的直接影響或破壞 了病毒增殖的抑制物�，F大多趨向認為，輪狀病毒復制方式不同于其它呼腸孤病毒， 它不是通過(guò)吞飲作用進(jìn)入細胞，而是通過(guò)胞漿膜直接進(jìn)入胞漿，其穿入依賴(lài)于Vp4 。這一過(guò)程是通過(guò)胰酶作用于Ｖp4，特異性裂解成Vp５和Vp8（6 ０kDa，28kDa），從而使病毒變?yōu)橛懈腥拘浴?類(lèi)似于流感病毒和副流感病毒在蛋白酶作用后，囊膜的糖蛋白被消除而使其感染 力活化。輪狀病毒的轉錄同其它正呼腸孤病毒一樣。胰蛋白酶處理不能使人的 輪狀病毒在細胞培養中適應。除某些牛、豬輪狀病毒株外，其它動(dòng)物的輪狀病毒在細胞培養物中增殖時(shí)，一般不 產(chǎn)生細胞病變，或只產(chǎn)生輕微而不穩定的細胞病變。大多數初代 分離物需要在細胞培養物中連傳幾代才能見(jiàn)到細胞致病作用。細胞病變表現為 細胞腫大變圓、脫落、顆粒增多、細胞變暗，有時(shí)出現融合灶及拉網(wǎng)現象。但 有時(shí)僅表現粗糙感，細胞并不脫落。有的毒株不產(chǎn)生細胞病變，需要用熒光抗體 法等手段檢測。輪狀病毒也可產(chǎn)生蝕斑，Matsuno等（1977）報道，覆蓋瓊脂中 含有胰蛋白酶時(shí)，輪狀病毒可以形成蝕斑，最佳配方據報道為乙�；让� （3μg/ml）、DEAEDextran（50μg/ml）以及06%純化瓊脂。除A型輪狀病毒外，其它輪狀病毒的許多毒株迄今未能適應細胞培養，分離的成功率 約在40%～70%，因此有時(shí)只能用經(jīng)口感染易感動(dòng)物來(lái)分離和復制病毒。自情侶鸚 鵡分離的一株輪狀 病毒，經(jīng)卵黃囊接種可致死雞胚。至目前為止，沒(méi)有有關(guān)其它禽輪狀病毒在雞胚 中增殖的文獻報道。悉生仔豬、悉生羔羊可用來(lái)增殖豬、犬、猴、馬、�；蛉说牟《�。更 為理想的動(dòng)物模型是小鼠，4～14日齡抗體陰性者感染率可高達95%，牛、猴或人的 毒株均可誘發(fā)腹瀉。
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