臨床上解脲支原體（uu）的檢測方法

(一)分離培養方法

Uu在含95% 氮氣和5%CO2 環(huán)境中生長(cháng)良好。其生長(cháng)最適pH為5.5-6.5,最適溫度為36℃-37℃。Uu具有尿素酶，能分解尿素產(chǎn)氨，使含酚紅指示劑的Uu液體培養基pH值上升，顏色由黃色變?yōu)榧t色。再將液體培養物轉種到Uu固體培養基上，能生長(cháng)成具特征性油煎蛋樣集落。

(1 )液體培養基：支原體肉湯培養基80mL，馬血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,
10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚紅溶液0.5mL,青霉素(使其在培養基中的濃度為500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 調pH值至5.5-6.5, 用小試管分裝后置冰箱中備用，每管1.5-2.0mL。

(2 ) 固體培養基：在100mL 支原體肉湯培養基中，加入瓊脂1.2-1.4g, ,高壓滅菌后冷卻到 50 ℃左右，逐一加入上述添加劑。搖勻，倒入無(wú)菌平皿中，待凝固后，置冰箱中備用。

接種標本后，經(jīng)孵育，若培養基發(fā)生由黃變紅的顏色變化，透明無(wú)混濁(有別于某些細菌及 真菌生長(cháng))則可初步判斷為有支原體生長(cháng)。大多數Uu在24h內可獲得陽(yáng)性結果。如果培養基發(fā)生顏色變化，但液體又有混濁，則應排除雜菌污染, 可用0.45μm濾膜過(guò)濾后，作再接種觀(guān)察。進(jìn)一步診斷需將液體培養物接種到固體培養基上培養, 經(jīng)Dienes法染色后在低倍顯微鏡下觀(guān)察集落形態(tài)。陰性結果最好觀(guān)察５天。Uu 在固體培養基上集落核心呈粗顆粒狀,具極窄的邊，有時(shí)呈油煎蛋樣。如用 Dienes 法染色，集落為特異的藍色。一般細菌的菌落不著(zhù)色，容易鑒別。

(二)代謝抑制試驗

根據特異性抗體能阻止支原體的生長(cháng)和代謝這一特性，可用病人血清進(jìn)行代謝抑制試驗。在加有抗血清的培養基中，支原體的代謝受到抑制，從而阻止了培養基的顏色改變。

代謝抑制試驗也可用于檢測感染支原體患者血清抗體的滴度。即將血清作10倍連續稀釋后，滴入支原體培養液，并以不加血清的支原體試驗管和不加支原體液的培養基管作對照。經(jīng)37℃培養，不加抗血清的培養管支原體應生長(cháng)良好，培養基變成紅色(Uu或Mh)，未加支原體液培養基管顏色不變。未發(fā)生顏色變化的最高血清稀釋度為代謝抑制試驗的抗體滴度。

(三) 間接血凝試驗

在一定條件下，抗體和相應抗原相遇，可形成抗原抗體復合物。這種復合物分子團很小,不能形成肉眼可見(jiàn)的反應。用經(jīng)鞣酸處理的紅細胞作載體，將抗原吸附在其表面，使紅細胞致敏，待與相應的血清抗體相遇時(shí)，可出現肉眼可見(jiàn)的凝集現象。

(四)生長(cháng)抑制試驗

特異性抗體能阻止支原體的生長(cháng)和代謝。用直徑為6mm-8mm的圓形滅菌濾紙片，以未稀釋抗血清浸透后放入無(wú)菌平皿內，于４℃下干燥后待用。 吸取待檢菌液0.5mL涂布于固體培養基上，置３7℃使瓊脂表面稍干燥。以無(wú)菌操作鑷取抗血清紙片放于瓊脂表面,培養4日-5日后,在低倍顯微鏡下觀(guān)察濾紙片周?chē)�有無(wú)支原體生長(cháng)。若濾紙片周?chē)鸁o(wú)菌落生長(cháng)，出現抑菌圈大于2mm者表示該支原體與抗血清系同種免疫原，小于2mm判為異種。

(五)分子生物學(xué)診斷方法

目前主要應用聚合酶鏈反應(PCR)法及DNA探針技術(shù)作診斷。前者具有高度特異性和敏感性、且快速、簡(jiǎn)便。但操作要求極為嚴格。

聚合酶鏈反應的原理是DNA片段擴增，其中支原體引物的選擇是PCR檢測技術(shù)中的關(guān)鍵。1９９1年Willonghby 設計的引物來(lái)自脲酶基因。Zheng等（1995）用MB抗原基因引物對所有14個(gè)血清型的Uu均顯示良好的PCR擴增效果，其敏感性較Willonghby設計的脲酶基因引物更好。

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