豬水皰病病毒-腸道病毒屬(Swine vesicular disease virus) 豬水皰病是近30年來(lái)新發(fā)現的一種豬的疫病。1966年10月首先發(fā)現于意大利Lombardy的豬群 中，認為這是一種在臨床上與口蹄疫具有相似癥候群的疾病。該病同時(shí)發(fā)生在兩個(gè)豬場(chǎng)，都 因從同一來(lái)源引進(jìn)豬而發(fā)病。意大利的Brescia口蹄疫研究所和英國的Pirbright動(dòng)物病毒研 究所進(jìn)行了一系列檢驗，都未能證明有口蹄疫病毒的存在，但發(fā)現一種腸道病毒，因此一致 認為這是不同于豬口蹄疫、水皰性口炎和水皰疹的一種新的豬的水皰性疾病。這些疾病雖然 臨床上相似，但可通過(guò)病原的理化學(xué)特性鑒定、動(dòng)物接種和血清學(xué)等方法加以鑒別(見(jiàn)表16 - 11)。香港地區隨后也發(fā)現豬水皰病。Mowat、Darbyshire和Huntley等報道(1972年)， 于1971年4月在香港新界一些農場(chǎng)中發(fā)現危害于豬的一種疫病，發(fā)病率比口蹄疫低，病情也 較溫和，通常不引起死亡。經(jīng)檢驗，香港地區的病毒與口蹄疫無(wú)關(guān)，而與意大利1966的病 毒相似，因此確認香港的豬水皰性疫病，也是由豬的一種腸道病毒所致。
英國從1972年12 月到1973年4月發(fā)生89個(gè)水皰病疫點(diǎn)；隨后豬水皰病又發(fā)生于波蘭(1972年)、奧地利(1972年 )和法國(1973年)。意大利于1972年10月重新暴發(fā)。以后在比利時(shí)(1973)、前西德(1973年) 、 東歐一些國家(1972年冬至1973年春)、瑞士(1974年)和荷蘭(1975年)等國也相繼發(fā)生了豬水 皰病。日本于1973年12月第一次在三個(gè)縣的15個(gè)豬場(chǎng)內發(fā)生豬水皰病。由于在歐洲的許 多國家相繼發(fā)生豬水皰病的流行蔓延，引起了世界肉食市場(chǎng)的混亂，1973年1月國際獸疫局 對此極為重視，專(zhuān)門(mén)召開(kāi)會(huì )議，研究措施，制定條例，并在這次會(huì )議上正式定名為“豬水皰 病”。豬水皰病引起嚴重的經(jīng)濟損失，以英國為例，1972年至1973年撲殺、銷(xiāo)毀42814頭 豬 ，價(jià)值100萬(wàn)英鎊，1972年至1974年僅賠償費一項就花費440萬(wàn)英鎊。
1、形 態(tài)特征 水皰 病病毒在電子顯微鏡下呈球形，超薄切片中的病毒粒子的直徑為22～23nm，磷鎢酸負染法測 定為28～30nm。Liebermann等測定病毒粒子的平均直徑為251±10nm，由裸露的二十面 立 體對稱(chēng)的衣殼和含有單股RNA的核心組成。在負染標本中，可見(jiàn)衣殼由許多空的圓筒形殼粒 構成。水皰病病毒在細胞胞漿內復制，成熟的病毒粒子經(jīng)常呈晶格狀排列，在發(fā)生病變的 細胞的胞漿空泡膜內凹陷處形成特異的環(huán)形串珠狀排列。這種特異的排列結構在病變中期的 宿主細胞內是能經(jīng)常見(jiàn)到的，偶而也可在一個(gè)細胞內同時(shí)看到病毒的晶格狀排列和環(huán)形串珠 狀排列。串珠狀排列的病毒粒子的形狀與大小非常均一，呈圓形，大小與晶格排列的病毒粒 子完全一致。在感染的倉鼠腎細胞培養物中，還�？梢砸�(jiàn)到由纖維樣結構包圍起來(lái)的小體 ，小體內充滿(mǎn)著(zhù)病毒粒子。
2、理化學(xué)特性 水皰病病毒的 沉淀系數為150±3S，分子量為 104×106Da。關(guān)于水皰病病毒的結構蛋白，Delagneau等應用1％十二烷基 硫酸鈉(SDS)和05mol/L尿素緩沖液100℃加熱一分鐘的方法，使病毒裂解，隨后在聚丙烯 酰胺凝 膠中進(jìn)行電泳，發(fā)現水皰病病毒粒子及空衣殼中有分子量分別為38 000和30 000 Da的兩 種 多肽存在�？找職んw的電泳圖像分成VP1及VP2兩個(gè)峰，但完整病毒粒子的兩個(gè)峰并不完 全分開(kāi)，在VP1和VP2兩峰之間有輕度的重疊。水皰病病毒的電泳泳動(dòng)能力不同于口蹄 疫病毒，水皰病病毒的VP1比口蹄疫病毒的VP1泳動(dòng)得遠，VP2也比口蹄疫的VP2泳動(dòng) 略遠。估計水皰病病毒VP1的分子量在37 000～39 000 Da之間，VP2的分子量在29 00 0～ 31 000 Da之間。根據豬水皰病病毒在氯化銫中的浮密度，又有浮密度為134g/ml的“ 輕 組分”以及浮密度為144g/ml的“重組分”兩種。約有98％的感染力寓于“輕組分”中。 “ 輕組分”和“重組分”都有相同的RNA和蛋白質(zhì)比例以及相同的多肽成分。在病毒復制過(guò)程 中，每一種成分又都產(chǎn)生同樣比例的“輕”、“重”兩個(gè)組分。水皰病病毒的“輕”、“重 ”兩種組分在酸性環(huán)境條件下都具有穩定性，不受pH30的影響，“重組分”的顆粒大小為 282±076nm，“輕組分”的顆粒大小為301±074nm，略大于“重組分”。在刺激機 體產(chǎn)生血清中和抗體的能力上，“重組分”的效力低，“輕組分”的效力高。尚未發(fā)現豬 水皰病毒有凝集紅細胞的作用。
3、抵抗力 水皰病病毒抵 抗乙醚和氯仿。1mol/L濃度的MgCl 2明顯提高病毒在50℃的穩定性。水皰病病毒在pH50、 40和30時(shí)皆穩定。據Hern iman 氏的報道，病豬糞便和血液中的水皰病病毒于pH39～96和5℃溫度下，可以存活164天， 不 喪失其感染性；但pH值低于288及高于1076時(shí)，則在164天后失去感染性。60℃2～10分 鐘 可使病毒滅活。 糞便中的 病毒在環(huán)境溫度為12～17℃時(shí)，可存活138天；但當環(huán)境溫度為25℃時(shí)，約28天病毒就被滅 活。動(dòng)物尸體在-20℃經(jīng)11個(gè)月仍有大量感染性病毒存在。2％氫氧化鈉溶液在25℃ 作用24 小時(shí)，使水皰病病毒滅活，但在0～4℃24小時(shí)，則尚不能滅活病毒。其它如5％氨水、3％福 爾馬林，都可殺滅病毒。1％過(guò)氧乙酸和次氯酸鈉能在短時(shí)間內殺滅水皰病病毒。細胞培 養的病毒液在37℃下經(jīng)144小時(shí)失去對細胞的致病變作用。用福爾馬林加氧化劑于25℃左 右溫度下薰蒸密閉的廄舍18～24小時(shí)，可以達到消毒目的。
4、增殖 應用原代仔豬腎細胞以及IBRS2、PK15和人羊膜傳代細胞FL等培養豬水皰病病毒，都 可產(chǎn)生明顯 的細胞病變：細胞變圓，固縮而呈顆粒狀，聚集成堆或散在。這些病變一般出現于接種病毒 后30多個(gè)小時(shí)。適應株甚至可在接種后10小時(shí)左右引起細胞病變。豬水皰病病毒易在IBRS 2傳代細胞上復制增殖，IBRS2細胞似乎對豬水皰病病毒特別敏感，每ml病毒液可達2×1 09個(gè)蝕斑形成單位。蝕斑呈圓形，邊緣整齊，通常在接種病毒后20小時(shí)開(kāi)始出斑，48小時(shí) 的蝕斑直徑為30mm左右，72小時(shí)可達60mm。水皰病病毒對牛源細胞培養物(如原代犢 牛腎細胞、原代犢牛甲狀腺細胞)和BHK21細胞不引起細胞病變。對原代鼠胚細胞和HeLa細 胞系能否產(chǎn)生細胞病變，報道尚不一致。某些水皰病病毒株較難適應原代倉鼠腎細胞，初 代感染接種時(shí)不出現細胞病變，但經(jīng)檢驗卻確有病毒存在。需傳到20代左右時(shí)才能出現規律 性的細胞病變。另外一些毒株較易適應原代倉鼠腎細胞，并產(chǎn)生比較明顯的細胞病變。水 皰病病毒感染的細胞培養物，在用免疫熒光抗體檢查時(shí)，可在病毒接種后3～5小時(shí)，就在胞 漿內看到顯示熒光的顆粒，這表明在胞漿內此時(shí)就有病毒成分的產(chǎn)生。原來(lái)認為水皰病病 毒和口蹄疫病毒在細胞培養中存在干擾現象，但是后來(lái)證明，在同一細胞培養物中同時(shí)或先 后接種二種病毒，都能產(chǎn)生較高的病毒滴度。
5、病原性 豬水皰病病毒除對本動(dòng)物(豬) 引起感染發(fā)病外，對其它家畜、家禽，如奶牛、水牛、黃牛、綿羊、山羊、馬、驢和雞等均 不引起發(fā)病。病豬發(fā)熱(41～42℃)，并于鼻鏡、蹄冠、蹄球和趾間皮膚上出現水皰。水皰直 徑1～3cm，常在2～3天內融合和破潰，并迅速愈合。皮下或皮內注射感染組織浸液或水皰液 于蹄球或蹄冠部，�？稍�36小時(shí)內于接種部或其周?chē)霈F水皰。此后迅速發(fā)展為全身感染， 并于趾間、鼻鏡和舌上出現水皰。實(shí)驗動(dòng)物，如2～3日齡的乳鼠和1～2日齡的乳倉鼠、吮 乳大白鼠都能感染發(fā)病。乳鼠表現特異的麻痹癥狀：四肢后伸，強直。初代分離時(shí)病程較長(cháng) ，小鼠在感染后5～6天死亡，用1045TCID50滴度以上的病毒腹腔接種乳鼠， 于接種后3～8天內引起麻痹死亡。7日齡以上的小鼠大多具有抵抗力。幼齡家兔不感染。多 數學(xué)者認為水皰病病毒不能引起豚鼠發(fā)病，但有人用跖部皮內穿刺接種法強迫適應，據云幾 代后可以使跖部出現輕度的水皰性炎癥。水皰病病毒不感染雞胚。
6、抗 原性 豬水皰 病病毒同口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒和水皰疹病毒沒(méi)有交叉免疫反應，四種病毒雖然都使 動(dòng)物產(chǎn)生相似的臨床癥狀，但抗原性不同。有人應用補體結合試驗研究豬水皰病毒各毒株 之 間的關(guān)系，將英國／1972、意大利／1966、法國／1973及香港／1971等4個(gè)毒株作交叉補結 試驗。從測定它們的R與r值的關(guān)系來(lái)看，4個(gè)毒株之間僅有微小的差異，這個(gè)差異同口蹄疫 亞型之間的差異值類(lèi)似。在中和試驗中，意大利／1966株、香港／1971株和法國／1973株彼 此不同，且與意大利／1972、英國／1972、澳大利亞／1973和波蘭／1973群毒株不同。瓊脂 擴散試驗也證明幾個(gè)毒株之間存在一些差異。應用RNase T1單向PAGE技術(shù)對不同時(shí)間、不 同地 區分離的8株水皰病病毒進(jìn)行比較，發(fā)現其可以大致分為三組，但均與日本／86參考株存在 差異。曾對不同地區的流行毒株進(jìn)行豬體交叉免疫試驗，結果幾個(gè)地區的毒株沒(méi)有表現出 太大的差異，互相能夠交叉免疫。Graves等(1976年)首次報道了豬水皰病病毒與人的一種 腸道病毒 柯薩奇病毒的關(guān)系，并且推測這種病毒可能是由人傳給豬的。該氏用抗 柯薩奇病 毒的血清對豬水皰病病毒進(jìn)行中和試驗，結果證明，無(wú)論是在細胞培養物上或于小鼠腦內接 種時(shí)，豬水皰病病毒都可被柯薩奇B5型血清所中和。另外，以B5型柯薩奇病毒和豬水 皰病病豬的康復血清進(jìn)行中和試驗，以PK15細胞為指示細胞，也都出現明顯的交叉中和現 象。人的B5型柯薩奇病毒經(jīng)用各種方法感染豬，都不引起臨床癥狀，但在豬體內卻可產(chǎn) 生高效價(jià)的中和抗體，這說(shuō)明病毒在豬體內是有活性的。迄今尚未見(jiàn)有人類(lèi)感染豬水皰病 的報道，但與水皰病病畜有接觸史的人或在實(shí)驗室內進(jìn)行此項工作的人，體內確能查到高效 價(jià)的水皰病病毒的中和抗體。豬水皰病病毒和B5型柯薩奇病毒之間的上述血清學(xué)關(guān)系， 似可說(shuō)明豬水皰毒病毒在人與豬之間傳布的可能性。因此有人斷言：豬的水皰病病毒很可能 就來(lái)源于人。Brown等(1976年)通過(guò)血清學(xué)和RNA雜交試驗發(fā)現近期分離的B5型柯薩奇 病毒8068株、9954株與原始Faulkner毒株有著(zhù)明顯的差異；而水皰病病毒與Faulkner毒株之 間的關(guān)系卻比上述二株B5型柯薩奇病毒株與Faulkner毒株之間差異要小。Harris等(1 975年)也對豬水皰病病毒和B5型柯薩奇病毒的多肽成分與抗原差異的關(guān)系進(jìn)行了研究。通 過(guò)RNA雜交試驗，發(fā)現水皰病病毒與原始的柯薩奇B5型(Faulkner)毒株，大約有50％的同 源性，而原始型柯薩奇病毒與后來(lái)分離的柯薩奇病毒株(如8068株、9954株)的RNA也有較大 差異。這說(shuō)明后來(lái)分離的毒株已經(jīng)有了某些改變，而且水皰病病毒與柯薩奇病毒二者之間有 著(zhù)比較密切的親緣關(guān)系。用35S蛋氨酸或3H氨基酸標記的水皰病 病毒和B5型 柯薩奇病毒，混合后在15%～45％(重量／體積)的蔗糖密度梯度中作離心沉淀試驗，結果也 發(fā)現兩種病毒的沉淀系數相似，而在氯化銫中的浮密度二者也相同 134～135 g／ml。用 十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解病毒粒子，再作聚丙烯酰胺凝膠電泳，可見(jiàn)水皰病病毒和B5型 柯薩奇病毒的多肽圖形不同，但各國在不同時(shí)間分離的水皰病病毒之間的多肽圖形也有顯著(zhù) 不同。由個(gè)別地區分離的水皰病毒株(如法國1／73)，其多肽圖形很像近期分離的B5型柯 薩奇病毒。
7、傳播 病豬的病變上皮組織和水皰液中含有 高效價(jià)的病毒，也可由淋巴結 、骨髓、扁桃體、肝臟和血液中分離到病毒，但含毒量較低，且較快消失。肌肉中的病毒含 量不高，但也曾有由患病后15天左右的病豬肌肉中分離到病毒的報道。病豬可由鼻腔 和 口腔排毒，持續10天左右，也可隨糞排毒6～12天。曾有尿亦含毒，且能直接致死1～3日齡 乳鼠的報道。豬水皰病的主要傳播方式是直接接觸感染。當健豬與病豬或帶毒豬同居混群 飼養，或用污染的飼料、泔水喂豬時(shí)，使健康豬感染發(fā)病。病毒可經(jīng)損傷的皮膚直接侵入機 體到達敏感部位 蹄、鼻鏡和口腔上皮組織，并形成特征性的水皰；也可經(jīng)口感染 ，從消化 道經(jīng)血液到達敏感部位產(chǎn)生水皰。豬水皰病的流行無(wú)嚴格季節性。當豬只調動(dòng)頻繁，大量 集中，氣候變冷時(shí)，發(fā)病率增高，達50％～90％。農村一家一戶(hù)飼養的豬的發(fā)病率較低。 豬水皰病病毒的傳播力不如口蹄疫病毒，所以流行比較緩慢，不呈席卷之勢。鼻鏡上出現水 皰的豬也不如口蹄疫多。英國在1972～1973年豬水皰病流行期間，發(fā)現本病的傳播主要通 過(guò)三個(gè)途徑：(1)用屠宰場(chǎng)病豬的殘屑或下腳料喂豬；(2)買(mǎi)進(jìn)病豬，直接傳播；(3)用污染 的交通工具運豬。被水皰病病毒感染的母豬所生的2～3日齡的仔豬也可發(fā)生感染，出現水 皰。野豬也被感染，呈現與家豬相同的癥狀。Sasahara等(1980年)從健康豬的糞便中分 離獲得1株可被水皰病免疫血清中和的病毒，因此認為豬群中可能存在隱性感染。
8、免 疫 動(dòng)物在自然感染水皰病后4天即在血液內出現一定滴度的中和抗體，且 能持續較長(cháng)時(shí)間 �；謴蛣�(dòng)物可產(chǎn)生堅強的免疫力。人工免疫接種也有良好的免疫效果。(1)弱毒疫苗① 鼠 化弱毒苗：系將自然流行的豬源強毒連續通過(guò)2～3日齡乳鼠30代以上而減毒育成的。病毒滴 度(LD50)一般可達10-70左右。制苗時(shí)應用30％甘油鹽水制備成感染乳 鼠肌肉 組織苗。免疫劑量為1∶100～500倍2ml。注射幼豬，應不引起臨床癥狀，攻毒時(shí)保護力應 在8 0％以上。免疫持續期可達6個(gè)月。此苗可與豬瘟兔化弱毒疫苗共用，不影響各自的效果。 ②細胞培養弱毒疫苗：系用原代仔豬腎細胞培育的弱毒株，病毒在接種后20～30多小時(shí)產(chǎn)生 中等度明顯的細胞病變，病毒滴度(TCID50)可達10-70～10- 80。一般 經(jīng)40、50代致弱，但也有需經(jīng)70代以上才能致弱的。組織培養弱毒苗對豬可能產(chǎn)生輕微反應 ，但不引起同居感染，是目前安全性較好的弱毒苗。但個(gè)別毒株在連續傳100代以上也不明 顯致弱，接種后還可引起同居感染，毒力迅速返祖。細胞培養弱毒疫苗的免疫保護率多在80 ％以上，免疫期可達4～5個(gè)月。細胞培養物中加入20～30％的甘油，可以提高疫苗的保存期 。也有應用仔豬睪丸細胞、胎豬腎以及倉鼠腎細胞或IBRS2細胞馴化培育 的弱毒疫苗株 。一個(gè)理想的弱毒疫苗株，應該既能在動(dòng)物體內增殖，但又不能產(chǎn)生組織損傷，且在敏感 動(dòng)物體內多次傳代后，繼續保持穩定特性。遺憾的是，經(jīng)上述途徑馴化培育的幾個(gè)弱毒疫苗 株，均未完全符合這樣的要求，實(shí)際應用中暴露出了許多弊病，目前已經(jīng)基本停用。(2) 滅活疫苗細胞培養滅活苗:原代仔豬腎細胞、倉鼠腎細胞和IBRS2傳代細胞均可用于疫苗 生產(chǎn)。細胞培養物的病毒滴度,TCID50為10-75左右,乳鼠LD50為10 -60以上。用最終濃度為01％的甲醛或006％的β丙內酯或005％的乙酰乙烯亞 胺(A EI)作為滅活劑。應用二乙烯亞胺(BEI)的效果更好。于4℃、26℃或37℃滅活6～24小時(shí)。佐 劑可用氫氧化鋁、油乳劑或氫氧化鋁皂素。疫苗安全可靠。注射量為3～5ml,注苗后7 ～10天產(chǎn)生免疫力。免疫保護力在80％以上。注射后4個(gè)月仍有堅強的免疫力。(3)被動(dòng)免 疫 高免 血清在應急情況下,可以應用自然發(fā)病后痊愈的豬血清,也可應用人工制備的豬高免血清, 作緊急預防接種。如果配合其它安全防制措施,可獲良好效果�？祻拓i血清一般采自自然痊 愈后一個(gè)月的 豬,血清中和效價(jià)應在log35～40以上。每頭豬注射4～8ml。自然痊愈康復后1個(gè)月的 豬 ,再經(jīng)一次人工攻毒 1∶5病毒液40ml多點(diǎn)注射。攻毒后15天采血,血清中和效價(jià)可 達log55。 每公斤體重注射02ml,可獲得良好的被動(dòng)免疫力。免疫期達30天。在飼養期短,周轉快, 調 動(dòng)頻繁的商品豬群中,合理使用高免血清的被動(dòng)免疫方法,�？蛇_到預防本病的效果。
9、 診斷 豬水皰病在臨床癥狀、病理剖檢變化上很難與口蹄疫等水皰性疾病相 區別,所 以診斷本病的主要著(zhù)眼點(diǎn)就是將其與口蹄疫等疾病進(jìn)行鑒別,請參閱表16-11。(1)病 毒分離: 采取病豬的水皰皮,洗凈、稱(chēng)重并研磨后,用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液制成1 ∶5～1 ∶10懸液,置4℃浸出一夜或在室溫浸出4小時(shí)。振蕩混合后,以3 000r／min離心沉淀10分鐘, 其上清液即為待檢病毒液。頸部皮下接種2～3日齡的乳鼠或乳倉鼠,或者IBRS2 、PK15等豬 腎傳代細胞。一般在最初1～2代內即可引起感染,實(shí)驗動(dòng)物發(fā)病、死亡,或使組織培養細胞出 現細胞病變。如果初代分離呈陰性結果,應繼續盲傳2～3代。(2)中和試驗:中和試驗是 診斷豬水皰病的常用方法,較易得出確切的診斷結果。①用已知血清鑒定未知病毒:選用2 ～3日齡的乳鼠,每窩10只,各以1只母鼠哺乳。分別注射已知的豬水皰病免疫血清和口蹄疫各 型免疫血清。每窩注射7只,留3只不注射,作為病毒對照。注射的豬水皰病免疫血清不稀釋, 口蹄疫血清測作1:4稀釋。每只頸背部皮下注射01ml。于注射血清后18～24小時(shí),接種如 上制備的待檢病毒液。于每窩注射過(guò)血清的7只乳鼠中,5只接種病毒液,留2只作為血清健康 對照。3只未注射免疫血清的乳鼠,也同時(shí)接種病毒液。每只頸背部皮下注射01ml。接種 病毒后,每天觀(guān)察2～3次,連續觀(guān)察6天。如注射豬水皰病免疫血清的乳鼠被保護,血清對照鼠 均健活,病毒對照鼠和注射各型口蹄疫免疫血清的乳鼠均發(fā)病死亡,則被檢病料為豬水皰病 病 毒,而不是口蹄疫病毒。②用已知病毒鑒定未知血清:于待檢血清中每ml加青、鏈霉素各1 000單位,室溫處理1小時(shí),或4℃處理4～5小時(shí)。選用2～3日齡乳鼠,每窩10只,各以1只母鼠 哺乳。以如上處理的待檢血清注射,每窩7只,留3只不注射作為病毒對照。每只乳鼠頸背部皮 下注射01ml。于注射被檢血清后18～24小時(shí),用豬水皰病病毒及口蹄疫各型病毒進(jìn)行接 種 。每一病毒接種一窩乳鼠。在每窩注射過(guò)被檢血清的7只乳鼠中,給5只接種病毒,留2只作血 清健康對照。未注射血清的3只乳鼠也同時(shí)接種病毒。每只乳鼠頸背部皮下注射01ml病毒 液(10-2～10-3稀釋,約含10 000LD50)。攻毒后觀(guān)察6天,每 天觀(guān)察2～3次 。如果接種豬水皰病病毒的乳鼠被保護,血清對照乳鼠健活,而豬水皰病病毒對照鼠以及用各 型口蹄疫病毒攻擊的乳鼠均發(fā)病死亡,則被檢血清中含有豬水皰病抗體,而不含有口蹄疫病毒 抗體 。必須指出,由于口蹄疫和豬水皰病的廣泛存在,同一份血清中可能同時(shí)具有抗口蹄疫抗體和 抗水皰病抗體。(3)反向間接紅細胞凝集試驗:一般應用丙酮醛甲醛法或戊二醛 甲醛法 固定綿羊紅細胞,并以提純的豚鼠抗水皰病IgG致敏,制成水皰病紅細胞診斷液。IgG的最適濃 度為50～100μg／ml,致敏過(guò)程在pH40的01mol/L醋酸緩沖液內進(jìn)行。具體操作方法請參 閱本書(shū) 第十四章有關(guān)節段。水皰病紅細胞診斷液在4℃可以保存5個(gè)月。 試驗在微量 滴定板上進(jìn)行。先將被檢材料(如水皰皮)用pH72, 011mol/L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水 洗 凈,稱(chēng)重后研磨,作成1∶3懸液,如上浸出制成待檢抗原。隨后將其在小試管中用內含1％兔血 清、005％聚乙二醇(分子量12 000)和01％疊氮化鈉的pH72,01mol/L磷酸鹽緩沖液 作倍倍稀釋 ,自1∶6、1∶12……1∶768。于微量滴定板的第一排1～8孔內分別滴加8個(gè)不同稀釋度的 待檢抗原,每 孔2滴。第9孔滴加稀釋液2滴,作為陰性對照。第10孔滴加水皰病標準抗原1:30稀釋液2滴,作 為陽(yáng)性對照。隨后于1～10各孔內滴加水皰病紅細胞診斷液1滴,輕輕搖震滴定板,使紅細胞 均勻懸浮后,置室溫下感作15～20小時(shí)后判定結果。有兩孔出現++以上凝集現象者,即 可判為 水皰病,但陰性對照孔應不凝集,陽(yáng)性對照孔應凝集。紅細胞凝集++以上的抗原最高稀釋度 ,即為該被檢抗原的效價(jià)。反向間接紅細胞凝集試驗雖然靈敏度較高,但個(gè)別被檢抗原可能 在 低倍稀釋孔內出現非特異凝集現象。必要時(shí),應以正常對照豚鼠的IgG同樣致敏已固定的綿羊 紅細胞,制成對照正常紅細胞診斷液。試驗時(shí),將待檢抗原如上稀釋后同樣滴加于微量滴定板 的第1排和第2排的1～8孔內,第9和第10孔仍為陰性、陽(yáng)性對照。隨后于第1排各孔內加入水 皰病紅細胞診斷液,第2排各孔內加入對照正常紅細胞診斷液。如上感作、判定。比較第1排 和第2排的凝集情況,根據兩排凝集滴度之差進(jìn)行判定,以相差兩孔以上者為陽(yáng)性。(4)免疫 熒光抗體法:將豬水皰病的水皰皮浸出液接種細胞培養物,隨后用熒光抗體鑒定細胞內的病 毒抗原。方法是在培養于飛片上的IBRS2、PK15或原代仔豬腎細胞單層上接種如上制 備的1∶10水皰皮浸出液02ml,吸附并補加維持液后,37℃孵育,經(jīng)不同時(shí)間后取出飛片,以- 20℃甲醇固定30分鐘,晾干后,滴加20倍稀釋的豚鼠抗水皰病免疫血清02ml,37℃感作30分 鐘,用PBS充分沖洗后,再加熒光素標記的兔抗豚鼠IgG，37℃染色30分鐘。經(jīng)PBS充分沖洗后, 晾干,鏡檢。應用大孔培養板培養細胞,直接接種水皰皮浸出液后,如上熒光染色,當然更為方 便。同時(shí)設豬水皰病病毒陽(yáng)性和陰性對照培養物以資比較。陽(yáng)性病料于接種后5小時(shí)開(kāi)始 出現熒光細胞,并隨時(shí)間的延長(cháng),熒光細胞數增多。但如病料中的病毒含量低,則常推遲至接 種后10～24小時(shí)才能檢出陽(yáng)性細胞。也可應用熒光抗體直接染色法,其與間接法的檢出結 果相 似。應用熒光抗體直接檢測病料,如水皰皮,效果常不理想。豬水皰病病毒和口蹄疫病毒在 熒光抗體檢查時(shí)不發(fā)生交叉反應。(5)補體結合試驗:一般應用微量補體結合試驗,各成 分的用量為0025ml。試驗在微量滴定板中進(jìn)行。添加溶血系統之前,置37℃感作結合1～4 小 時(shí)或4℃18小時(shí)。后者的檢出率略高于前者。將水皰皮等被檢病料如上作成浸出液后直接 檢 測。(6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):檢測病料或細胞培養物中的病毒抗原,一般應用雙抗 體夾心法:應用提純的豬或豚鼠高免血清(見(jiàn)“附”)IgG,包被40孔酶標板,作為固相載體;隨 后滴加被檢抗原,感作并沖洗后,用含10％馬血清的PBS液封閉,37℃感作并沖洗后,再加酶標 記的同源(豬或豚鼠)高免血清IgG,即酶結合物。再經(jīng)感作和沖洗,最后加入底物顯色,測定O D值進(jìn)行判定。有人應用抗水皰病病毒的單克隆抗體制備酶結合物,據云檢測效果更為理 想。也可應用瓊脂擴散試驗和放射免疫測定等診斷方法,請參閱本書(shū)第十四章有關(guān)內容。 附:豬水皰病豚鼠高免血清的制造 1、抗原制備 選用抗原性良好的豬水皰病乳鼠 適應毒,接種乳鼠,待其發(fā)病瀕死時(shí)采取感染肌肉組織,在磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中研磨成1 ∶2～1∶3懸液。于4℃浸出過(guò)夜,3 000r／min離心沉淀10分鐘,吸取上清液。病毒滴度(LD 50)需在10-7以上。保存于4℃冰箱內備用。 2、免疫注射方法 選用體重在500g左 右的健康豚鼠10～15只,免疫注射4次,各次間隔4～5天。方法和劑量如下:第一次 兩后肢 腳掌穿刺接種04ml,皮下06ml;第二次 皮下注射15ml,肌肉注射05ml(加 05％皂素); 第三次 皮下注射30ml,肌肉注射15ml(加05％皂素);第四次皮下注射60ml。于最 后一次注射后的第10～12天,心臟采血,分離血清。56℃滅活30分鐘后,加防腐劑,分裝備用。 3、效價(jià)測定 將血清作成1∶5、1∶10、1∶20、和1∶40稀 釋液,分別注射2～3日齡乳 鼠7只,每只頸背皮下01ml。18～24小時(shí)后用10-2稀釋的豬水皰病病毒攻擊。同時(shí)設 血清對 照和病毒對照各2只。觀(guān)察6天。血清的保護效價(jià)應在1∶5以上。血清效價(jià)遠較康復豬血清為 低,可能是豚鼠對水皰病病毒比較鈍感的緣故。 4、特異性檢查 將血清作1∶5稀釋 ,注射5窩乳鼠,每窩注射7只,每只頸背部皮下01ml。18～24小時(shí)后分別用10-2～10 -3 的口蹄疫各型病毒和水皰病病毒攻擊,每只頸背部皮下注射01ml。另設血清、病毒對照各2 只,觀(guān)察6天。如果血清對照乳鼠健活,而以各型口蹄疫病毒攻擊的乳鼠均發(fā)病死亡,以水皰病 病毒攻擊的乳鼠被保護,即證明血清的特異性良好。
上一篇：腸道病毒屬
下一篇：鴨肝炎病毒-腸道病毒屬
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
