口蹄疫病毒診斷

診斷 �タ谔阋叩呐R床診斷根椐癥狀，亦即口和蹄部的水皰和爛斑， 并考慮流行病學(xué)材料。�ビ捎诳谔阋�、水皰性口炎、水皰疹和豬水皰病等4種疾病極為相似 ，故應首 先加以鑒別。如果補體結合試驗和免疫保護試驗不能作出最后結論，則應進(jìn)行病毒理化學(xué)特 性鑒定、細胞感染范圍試驗以及動(dòng)物接種試驗，見(jiàn)表16—11。在已確定為口蹄疫病毒之后， 再作型和亞型的鑒定。�ザ拘丸b定包括生物學(xué)和血清學(xué)兩種方法。生物學(xué)方法是用牛、豚鼠或 乳鼠進(jìn)行交叉免疫試驗以及應用豚鼠和乳鼠進(jìn)行血清保護試驗。血清學(xué)方法包括補體結合試 驗、中和試驗和瓊脂擴散試驗。��(1) 病毒的分離：�プ曰夹蟛×现蟹蛛x病毒，是最可靠的 診斷方法。通常應用實(shí)驗動(dòng)物、雞胚和組織培養細胞。�ゲ×系牟扇∨c保存是否恰當，直接 影響分離的成功率。一般采取水皰皮和水皰液作為病毒分離材料。牛應采取舌表面的水皰皮 ，蹄叉和蹄冠部的水皰皮常有比較嚴重的細菌污染。豬則采取鼻突部或蹄叉間、蹄冠的水皰 皮。水皰皮應早期采取，亦即選擇新鮮未破潰的水皰。已經(jīng)潰爛或腐敗的水皰皮不宜作病毒 分 離用。水皰皮必須同時(shí)采自幾頭病畜：牛2頭以上，豬5頭以上。采取后立即投入50%甘油磷 酸鹽緩沖液內，并迅速冷藏。水皰液在無(wú)菌條件下采取，可用滅菌的1～2ml注射器直接由未 破潰的水皰內抽取。也可應用食管探杯(cup probang)采集牛羊的食管-咽頭分泌液， 每次 5ml，采集后立即加入等量的細胞培養用維持液，并劇烈振蕩1分鐘后應用或保存備用。 �� 表16-11口蹄疫病毒與三種水皰性病毒的區別�� 口蹄疫病毒 水皰性口炎病毒 豬水 皰疹病毒 豬 水皰病病毒 (一)歸屬��

 �ビ麑⒉×纤椭吝h處檢驗時(shí),應將其置于盛有冰-鹽混合物的保溫瓶。�ア賾�用實(shí)驗動(dòng) 物的病毒分離法:常 用乳鼠和豚鼠分離與鑒定病毒。�� 乳鼠接種 〓將病畜水皰皮置于平皿內,以 滅菌的pH7��6磷酸鹽緩沖液沖洗4~5次,并用滅菌濾紙吸干。稱(chēng)重后置于滅菌乳缽中,剪碎,加 入適量海砂磨成糊狀。按水皰皮重量加pH7��6的磷酸鹽緩沖液制成1:5的懸液(懸液濃度可按 實(shí)際情況適當增減)。如有水皰液,可在此時(shí)加入。為防止細菌污染,每ml加入青、鏈霉素各1 00 0單位,置2~4℃冰箱內浸毒4~6小時(shí),然后以3 000r/min的速度離心沉淀10~15分鐘,吸取上清 液 備用。�ト�4~7日齡乳鼠10只,于頸背部皮下接種上述病毒感染液0��2ml。自接種后18小時(shí)開(kāi) 始,每隔1~2小時(shí)檢查一次。如果病料內含有口蹄疫病毒,被接種乳鼠一般在接種后20~30小時(shí) 出現典型的口蹄疫癥狀。發(fā)病乳鼠運動(dòng)不靈活,用鑷子夾尾巴或四肢,�？砂l(fā)現其已失去知覺(jué) 。隨后四肢麻痹,呼吸促迫,最后死亡。如于注射后12小時(shí)內死亡,則多因注射技術(shù)不佳或其 它非特異感染所致。�ミx出發(fā)病死亡的乳鼠,用0��1%新潔爾滅或2％石碳酸溶液浸泡30分鐘, 隨后將其仰臥固定于盛有石蠟的平皿或木板上,再用75％酒精棉球消毒皮膚。由正中線(xiàn)剪開(kāi) 皮膚,并向四肢延伸,剝離皮膚,除去頭、四肢以及胃腸和膀胱等,采取骨骼肌作為接種材料。 將其研磨后制成10％懸液作傳代接種用。�� 豚鼠接種 〓水皰皮的處理方法同 前。選擇400g體重以上的健康豚鼠3～5只,先剪去后肢跖部邊緣的被毛,以75％酒精棉消毒接 種部位,再以滅菌的干棉球擦干。用注射器和5號針頭抽取接種液,在豚鼠兩后肢跖部皮內垂 直穿刺6針,橫行穿刺4針,皮內穿刺注入感染液0��2ml,再于跖部皮下注入0��2～0��4ml。感 染豚鼠一般在接種后36~48小時(shí)于接種部形成口蹄疫的特征性水皰,嚴重時(shí)起立困難。�ア趹�用雞胚的病毒分離法:以靜脈注射為最易感。選用12～14日齡的雞胚。在暗室內用 照卵燈找到較粗的靜脈,并用鉛筆標明其位置和血流方向。以75％酒精棉消毒后,用銼或烙印 器在卵殼上銼出或烙出一個(gè)2～3mm寬、5～6mm長(cháng)的長(cháng)方形(切勿割破殼膜)。再用外科刀將此 長(cháng)方形的卵殼挑起、揭去,并在暴露的殼膜上滴加滅菌液體石蠟1滴,使殼膜透明。此時(shí)即可 見(jiàn)到靜脈。用磨過(guò)的4號針頭朝血流方向刺入靜脈內,注射1∶10的病毒液0��02ml。如果靜脈 內出現血流暫時(shí)中斷,靜脈呈白色,則即證明確已注入靜脈。將卵殼缺口用蠟紙或膠布封固后 ,置36～36��5℃溫箱中孵育。每隔24小時(shí)檢查一次。在接種后24小時(shí)內死亡者棄去。選取于 接種后72～96小時(shí)內死亡的雞胚,于0～4℃冰箱中靜置4～10小時(shí),隨后采胚,除去頭和爪(一 般見(jiàn)不到雞胚病變),用肌肉作下代接種材料。如果雞胚健活,也在接種后96小時(shí)采胚,如上處 理后盲傳。�ア蹜�用組織培養細胞的病毒分離法:口蹄疫病毒可在牛舌上皮、牛腎、豬腎、 豚鼠腎、倉鼠腎和兔腎等原代細胞以及豬腎和乳倉鼠等細胞系內增殖。��將病毒材料置于乳 缽內用滅菌剪刀剪碎,并加適量玻璃砂或海砂研磨均勻,加入pH7��6的磷酸鹽緩沖液制成1∶3 的懸液。滴加抗生素溶液,使每ml懸液含青、鏈霉素各100單位。再按懸液量加入20％氯仿, 置0～4℃冰箱中浸毒4～6小時(shí)。以2 000r／min的速度離心沉淀10～15分鐘,吸取上清液,供 組織培養細胞 的感染用。�ミx擇已長(cháng)成單層的細胞管,吸出舊營(yíng)養液,并以Earle氏液沖洗2次,每管接種病 毒材料0��05ml,置37℃溫箱中吸附60分鐘,隨后再加不含牛血清的維持液0��95ml(pH為7��6 ～7�� 8)。繼續置37℃溫箱孵育。在接種后24小時(shí)開(kāi)始用低倍顯微鏡觀(guān)察有無(wú)細胞病變出現。一般 在接種后36～48小時(shí)即可出現比較明顯的細胞病變。吸出感染細胞培養液,置-20℃保存 或作傳 代和病毒鑒(滴)定。��(2)病毒型的鑒定:�ネǔ�應用O、A和C等各型標準陽(yáng)性血清進(jìn)行補體 結合試驗,鑒定上述分離的毒株或者直接用以鑒定病畜水皰皮內的病毒抗原。應用補體結合 試驗鑒定水皰皮內的病毒抗原,�？稍�2～3小時(shí)內得出結果,故是目前普遍應用的方法。鑒定 口蹄疫病毒及其型,也可應用瓊脂擴散試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和交叉免疫保護 試驗。

�ア傺a體結合試驗�シ磻�原理和基本術(shù)式與一般補體結合試驗相同, 請參閱本書(shū)第十 四章有關(guān)節段。��

 �パa體的工作量是滴定度再加1 ％(習慣上叫二個(gè)單位)。如滴定度為0��2ml,也就是在一個(gè)劑量?jì)群?％的純補體,則其工作 量 應該是3％。本試驗更要用四個(gè)補體量。如果2單位是3％,則其余三個(gè)量為:3單位是3��5％,4 單位是4％,5單位是4��5％。故在此條件下,補體的滴定度不能低于0��25ml,否則5％(即1∶2 0 )的補體就不能用了。�� 標準陽(yáng)性血清 〓系用豚鼠制造,即用各種口蹄疫病毒 的豚鼠適應株多次免疫而得。因A和O型病毒�？梢�起100％或將近100％的死亡,所以需先進(jìn) 行基礎免疫。選取體重500g以上的豚鼠20只,第1次股內側皮下注射10����-4��稀釋病 毒液0�� 5ml,3～4天后注射同樣稀釋度的病毒液0��6ml,再隔3～4天,皮下注射10����-3��稀釋 病毒液 0��4ml。并于末次注射后7～10天以10����-2��稀釋的病毒液皮內注射兩后肢的跖部皮 內。豚 鼠大多發(fā)病,但經(jīng)2～3星期后痊愈,此時(shí)再作高度免疫注射。也可先用氫氧化鋁甲醛滅活疫苗 作股內側皮下注射2ml,腳掌皮內注射0��2ml,14天后以10����-2�獜姸酒�內注射兩后肢 跖部,豚鼠可能發(fā)病,待其痊愈后,再作高度免疫注射。�ジ叨让庖咦⑸鋾r(shí),以10����-1�� 稀釋的 病毒液皮內注射于兩后肢跖部,共4～5次,每次間隔3～4天,第1次0��2ml,以后逐漸增加,最后 一次注射0��5～0��6ml。于末次注射后7～8天心臟放血,析得血清,56℃30分鐘滅活,并加入0 ��1 ％杞奴鎖防腐。4℃冰箱保存備用。有效期在1年半以上。��C型病毒對豚鼠的致死力較低,可 直接用10����-1��稀釋的病毒液作后肢跖部皮內接種,待其發(fā)病痊愈后,再如上述用10 ����- 1��稀釋的病毒液作高度免疫注射。

 被檢抗原 〓采取病牛 、病豬或人工感染的豚鼠水皰皮,以pH7��6磷酸鹽緩沖液或生理鹽水連續沖洗4～5次,用滅菌 濾紙吸干后稱(chēng)重,置滅菌乳缽中用消毒剪刀剪碎,其中加入適量玻璃砂或海砂充分研磨均勻, 再加二倍量的pH7��6的磷酸鹽緩沖液,放置室溫1～2小時(shí)或0～4℃冰箱浸毒24小時(shí),取出后以 3 000r ／min的速度離心沉淀15分鐘,吸取上清液,置58℃水浴中滅活40分鐘,即為被檢抗原。�ト绻� 是用人工感染的乳鼠,則選取其在18～48小時(shí)內死亡的,無(wú)菌采取肌肉,稱(chēng)量后置滅菌乳缽中, 加砂研磨成糊狀,然后加pH7��6磷酸鹽緩沖液,配成1∶2懸液,置室溫中浸毒1小時(shí),再以3 000 r／min 的速度離心15分鐘,取其上清液放置58℃水浴中滅活40分鐘,作為被檢抗原。�ゼ毎�培養病 毒可直接58℃滅活40分鐘后進(jìn)行檢測。�� 標準抗原 〓用O、A和C型豚鼠適應 毒 株分別接種豚鼠后肢的跖部皮內,經(jīng)18～24小時(shí)采取注射部位形成的第一期水皰皮,如上于乳 缽內加砂研磨成糊狀,并用pH7��6的磷酸鹽緩沖液作成10％的懸液,室溫浸毒1小時(shí),再以3000 r／min 的速度離心沉淀15分鐘,取其上清液置58℃水浴中滅活40分鐘,即成標準抗原。標準抗原在制 成后需以同型標準血清作效力滴定,用其它型標準血清作特異性檢查。

 反應時(shí)間完了后,可以立即評定結果,也可在6～12小時(shí)后再評定一次。�ジ餍脱�清中4管 都 全溶血,或僅第1管記“+”的,為陰性反應;補體3單位(第2管)以上,記“++++”的,為陽(yáng)性反 應;僅第1管記“++++”的為可疑,需重復試驗。�ジ鶕�以上試驗結果,該被檢材料為O型口蹄 疫病毒。�ケ仨氈赋�,在口蹄疫病毒的四種抗原中(病毒粒子抗原、12S亞單位抗原、75S空 衣殼和VIA抗原),只病毒粒子抗原和空衣殼具有型特異性。在應用補體結合試驗定型時(shí),往往 由于存在VIA抗原、12S抗原而受到干擾。將待檢抗原和標準抗原以58℃滅活40分鐘,就是為 了消除這種非特異性干擾。提高標準陽(yáng)性血清的稀釋度,也有降低這種非特異性干擾的作用 。�ト缧柽M(jìn)一步鑒定亞型,則可應用該型病毒中的各個(gè)不同亞型的標準血清,與被檢抗原和標 準抗原進(jìn)行交叉補體結合試驗,隨后計算r值和R值進(jìn)行判定。請參閱本章“抗原性”一節。 �パa體結合試驗也可反過(guò)來(lái),應用已知的標準抗原檢測動(dòng)物血清中的抗體,進(jìn)行抗體型的鑒定 ,操作方法同上。

�ア� 瓊脂擴散試驗 ��將優(yōu)質(zhì)瓊脂配成5％濃度,15磅 高壓30分鐘。待自然沉 淀后,將瓊脂倒于方形搪瓷盤(pán)中,凝固后切去底部雜質(zhì),并將瓊脂切成3～4mm��3的小塊。置雙 餾水中浸泡48小時(shí),每日換水三次。再用內含1／萬(wàn)硫柳汞的pH7��6磷酸鹽緩沖液浸泡4小時(shí) 以 上,移置4℃冰箱中保存備用。這樣處理的瓊脂,在澆制瓊脂板后十分澄清,便于觀(guān)察弱陽(yáng)性反 應。制板時(shí),取瓊脂小塊50g,瀝去緩沖液,加入pH7��6磷酸鹽緩沖液200ml,在水浴中加熱溶化 , 溶化后加入疊氮化鈉或硫柳汞防腐,并再加入氯化鈉,使其最后含量為7��5％,充分混合,即成 1 %～1��5％瓊脂凝膠,趁熱分裝于平皿中,直徑10cm的平皿裝10ml,5mm平皿裝6ml,瓊脂凝膠的 厚 度為0��3～0��4mm。待瓊脂凝固后,用打孔器打孔,孔徑為0��5mm,孔間距為0��4mm。置37℃ 溫箱中孵育24小時(shí)后應用。如系優(yōu)質(zhì)瓊脂粉,則可直接用7��5％NaCl溶液配制成1％瓊脂。�ゴ龣z材料(抗原)為從水皰中吸取的淋巴液,或者采取水皰皮或其它含毒組織以PBS研磨成1∶1 0乳劑,置4℃浸出24小時(shí),3000r／min離心沉淀10分鐘后吸取上清液檢查。細胞培養毒可直接 用作待檢抗原。�ビ谥醒肟變鹊渭哟龣z抗原,周?chē)�孔內滴加各型標準�?yáng)性血清,均添加至孔滿(mǎn)為止,再置25～30 ℃溫箱中孵育過(guò)夜,次日每隔4～6小時(shí)觀(guān)察一次。在抗原孔與血清孔之間出現灰白色沉淀線(xiàn) 者為陽(yáng)性反應。沉淀線(xiàn)大多偏近抗原孔。通常有兩條明顯的沉淀線(xiàn),靠近抗原孔的一條粗而 長(cháng),呈孤形,靠近抗體孔的一條短直而細。但有時(shí)出現一條渾濁而粗短的沉淀線(xiàn),這是 兩條線(xiàn)重疊的結果。�ト绻�中間孔中注加待檢血清,而在周?chē)�孔中注加各型標準抗�?即可檢 測抗體的型。��

③ 交叉免疫保護試驗 �ヒ源�鑒定的病毒材料接種�；� 豚鼠等動(dòng)物,待其 發(fā)病痊愈后再用已知型病毒攻擊,根據保護情況,鑒定病毒的型。牛在舌面接種,豚鼠在后肢 跖部接種。經(jīng)14～21天待動(dòng)物發(fā)病痊愈后,將其分成幾組,每組至少二頭,再用已知O、A、C等 型病毒分別攻擊,接種部位及方法同上。每組另設對照二頭。經(jīng)攻毒后觀(guān)察7天,如“O”型組 的兩頭不發(fā)病,而對照動(dòng)物和“A”、C型組均發(fā)病,即可認為待鑒定材料中含有“O”型病毒 。也可應用乳鼠進(jìn)行交叉保護試驗,即取乳鼠3窩各10只。3窩分別注射O、A、C型標準血清,6 ～24小時(shí)后,以待鑒定病毒材料攻毒。根據保護結果,判定毒型,具體方法參閱本書(shū)豬水皰病 病毒“診斷”節。

�ア� 中和試驗 ��應用A、O、C型的標準血清,與待鑒 定病毒懸液混合并感作 后,接種乳鼠或敏感細胞培養物。具體操作方法請參閱本書(shū)第十四章有關(guān)節段。

�ア� 酶聯(lián)吸 附試驗 (ELISA)�ソ�年來(lái),ELISA已在口蹄疫的診斷中逐步代替補體結合試驗以及 中和試驗。 檢測田間樣品時(shí),ELISA的敏感性高于補體結合試驗;對于含毒量較高的樣品,例如新鮮的水皰 皮和細胞培養物,可在2～4小時(shí)內獲得結果。應用預先在實(shí)驗室內包被的免疫反應板以及凍 干劑,將更便于現場(chǎng)檢測。根據檢測目的的不同,可用雙抗體夾心法及其變法進(jìn)行病毒抗原 的檢出,也可應用阻斷夾心法等測定血清中的病毒抗體。英國Pirbright實(shí)驗室應用免疫牛群 血清,對田間分離毒株與參考毒株進(jìn)行比較研究,可以迅速確定流行毒株的型和亞型,乃至發(fā) 現 新的具有獨特抗原性差異的毒株,從而能在最短時(shí)期內選定參考毒株或新分離毒株制造相應 的滅活疫苗。有關(guān)ELISA的具體操作技術(shù),請參閱本書(shū)第十四章。