兔出血癥病毒

兔出血癥病毒��(Rabbithemorrhagicdiseasevirus)

 兔出血癥(RHD)是兔的一種急性高度接觸性傳染病。以呼吸系統出血，實(shí)質(zhì)器官水腫、淤血及出血性變化為特征。本病于1984年初，首先在我國江蘇等地爆發(fā)，隨即蔓 延到全國多數地區。此后，世界上許多國家和地區也報道了本病。�ピ谖覈�確證兔出血癥以后，歐洲進(jìn)行了兔出血癥病毒(RHDV)的病毒學(xué)和血清學(xué)回顧性調查，發(fā)現1982年保存的病料中即含有兔出血癥病毒(RHDV)相關(guān)的病毒，他們還從保存了12～13年的血清樣本中檢出了相 關(guān)的病毒抗體，這說(shuō)明該病毒在歐洲的兔群中已經(jīng)存在了許多年 ，但當時(shí)歐洲的兔群中并沒(méi)有爆發(fā)RHD。鑒于中國在八十年代初期大量從西德引進(jìn)長(cháng)毛兔，1984年開(kāi)始爆發(fā)RHD，有人推測，很有可能是隨 著(zhù)生態(tài)環(huán)境的變化，使原來(lái)存在于歐洲但基本上無(wú)致病性的家兔或野兔杯狀病毒突 變成為RHDV而首先在中國出現，并引起疫病爆發(fā)。�� 圖17-2 兔出血癥病毒的形態(tài)結構�オ�

理化學(xué)特性�� RHDV在氯化銫中的浮密度為1��29～1��34g/cm ��３，沉降系數為85～162S。對乙醚、氯仿和pH3有抵抗力，能夠耐受50℃1小時(shí)的處理。 RHDV含有一條單股正鏈RNA，由7437個(gè)核苷酸組成，分子量為2��4×10��６～2��6×10�� 6，5’末端沒(méi)有帽狀結構，而代之以與感染性相關(guān)的VPg蛋白，3’末端具有一個(gè)短的P oly(A)尾。RNA基因組含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，5’末端的ORF編碼一個(gè)23 44氨基酸的多聚蛋白前體。該前體被病毒蛋白酶進(jìn)一步分解為衣殼蛋白和非結構蛋白，其中衣殼蛋白的分子量為65kDa，該ORF相當于其它杯狀病 毒的ORF1和ORF2(見(jiàn)圖17-1)。3’末端含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF),可能編碼一 個(gè)小的蛋白。�コ�基因組RNA外，病毒顆粒中還含有2��2kb的亞基因組mRNA,它轉錄自基因組衣殼蛋白基因3’末端，編碼衣殼蛋白。�プ罱�(1995)，比較RHDV基因組5’末端的460 個(gè)核苷酸發(fā)現，分離自埃及、法國、德國、西班牙的多株RHDV，其差異僅有1��3%～3��4%， 說(shuō)明RHDV自出現以來(lái)，尚未發(fā)生大的變異。

��3.血凝性�ネ贸鲅�癥病毒與其它杯狀病毒相比，最顯著(zhù)的特點(diǎn)是具有血凝性，RHDV能夠凝集人類(lèi)的各型紅細胞，肝病料中的病毒血凝效價(jià)可達10×2����20��，平均為10×2����１４��；RHDV也凝集綿羊、雞、鵝的紅細胞，但凝集能力較弱；不凝集其它動(dòng)物的紅細 胞。紅細胞凝集試驗(HA)在pH4��5～7��8的范圍內穩定，最適pH為6��0～7��2；如pH低于4 ��4，則會(huì )導致溶血；pH高于8.5，吸附在紅細胞上的病毒將被釋放。該吸附釋放現象可用于RHDV的提純。�パ�凝素對氯仿、乙醚、受體破壞酶(RDE)、過(guò)碘酸鉀不敏感，甲醛因滅活病毒而使HA效價(jià)下降，胰酶、硼氫化鈉、氯胺T等則可使血凝素的活性完全喪失。

��4.抗原性HI試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA和中和試驗證實(shí)，世界范圍內的RHDV均為同一 血清型。歐洲野兔綜合癥病毒(EBHS)與RHDV抗原性相關(guān)，但血清型不同，前者的抗血清不能 抑制RHDV的血凝作用，用RHDV特異性單克隆抗體或高免血清作ELISA、免疫電鏡、免疫印跡 可將二者區分開(kāi)來(lái)，動(dòng)物交叉保護試驗和傳遞試驗也顯示二者之間有較大的差異。

��5.增殖�ネ贸鲅�癥病毒不能在雞胚上增殖，也難于在各種原代或傳代細胞中穩定增殖，至今尚未真正找到一種能夠使其長(cháng)期傳代的細胞。吉傳義等報道，該病毒至少可在兔 腎傳代細胞上增殖10代，傳至第3代以后，細胞開(kāi)始出現規律性的病變，于接種病毒后24～ ７２小時(shí)內，大量細胞變圓、凝聚和脫落，但從傳代后的病毒接種培養物中，只能檢測到很低的血凝價(jià)，甚至沒(méi)有血凝性。蕭慶麟等報道，RHDV接種Vero細胞和MA104細胞均可產(chǎn)生細 胞病變，在Vero細胞上的細胞病變表現為細胞萎縮、部分變圓和脫落，但傳至第三代以后，病變消失。羅經(jīng)等報道，RHDV同步接種乳兔腎(RK)細胞或乳兔肺(RL)細胞48～72小時(shí)后，產(chǎn)生細胞病變，并能觀(guān)察到特異性熒光。這些結果都有待于進(jìn)一步證實(shí)。��

6.病原性�ヒ�進(jìn)的純種兔和雜交兔比我國本地兔易感，毛用兔比肉用兔易感。在自然條件下 ，RHDV只感染年齡較大的家兔，2月齡以下的仔兔自然感染時(shí)一般不發(fā)病，人工感染3～5日 齡初生兔，即使大劑量攻毒亦不發(fā)病。未發(fā)現野兔自然感染造成的大批死亡，人工感染野兔不發(fā)病 ，但可產(chǎn)生低滴度的特異性血凝抑制抗體(1∶5～1∶40)。其它動(dòng)物均無(wú)易感性。病死兔 的內 臟、肌肉、皮毛、排泄物、分泄物均可帶毒，可通過(guò)直接接觸而傳播，也可以通過(guò)被污染的飼料、飲水、籠具以及剪毛、醫療器械和人員來(lái)往而間接傳播。消化道、呼吸道、生殖道及 損傷的皮膚均可成為病毒侵入途徑。�ト斯じ腥镜臐摲�期為16～７２小時(shí)，自然病例的潛伏期為2～３天。最急性病例多見(jiàn)于新疫 區及流行初期，一般無(wú)任何前驅癥狀，死前數小時(shí)突然倒地，呈昏迷狀態(tài)，臨終時(shí)表現出短暫的興奮，而后掙扎、抽搐，尖叫幾聲后猝死，典型病例可見(jiàn)鼻孔中流出鮮血。急性病例體 溫升高至40��5～４１℃或更高，精神萎頓，皮毛松亂，食欲廢絕，呼吸迫促，瀕死期全身 癱瘓，橫臥不起，反射消失，一般在癥狀出現后6～8小時(shí)內死亡，孕兔會(huì )發(fā)生流產(chǎn) 。溫和型病例僅出現輕度體溫反應，精神不振，食欲減少和呼吸加快等，除非仔細觀(guān)察很難發(fā)覺(jué)，病程4～5天，一般不死亡。這類(lèi)病兔可帶毒和排毒，是很危險的傳染源。�ネ贸鲅�癥的病變特點(diǎn)是各組織器官彌漫性的點(diǎn)狀出血和實(shí)質(zhì)器官的淤血、水腫和變性 。鼻腔、喉和氣管粘膜彌漫性充血、出血，氣管內充滿(mǎn)大量血染泡沫；肺臟上有數量不等大小不一的出血斑、出血點(diǎn)，并有水腫；心臟擴張、淤血，心包積液；心包膜點(diǎn)狀出血；肝臟 腫大，呈土黃色或淡黃色，水腫，質(zhì)脆；脾臟淤血，腫大，腎臟淤血，呈暗紫色；十二指指腸粘膜、回腸粘膜、內分沁腺、性腺、輸卵管和腦膜亦可見(jiàn)充血和出血。組織 學(xué)檢查可見(jiàn)肝、肺、心、延髓等重要組織器官的微血管形成彌漫性血 管內凝血，間質(zhì)水腫，實(shí)質(zhì)細胞廣泛變性和壞死。�サ�澳大利亞的學(xué)者報道，當地出血癥死亡兔可能看不到出血，他們認為出血不是本病的一個(gè) 突出特征。�� 用HA法和ELISA法檢測人工感染家兔，發(fā)現病毒主要存在于肝臟，臨死前才進(jìn)入血液。死 亡兔各臟器中的病毒含量由高至低依次為肝臟、血液、脾臟和肺臟，而腎、胸腺、心肌、腦、腸和骨骼肌的病毒含量很低。用免疫熒光和免疫膠體金法證明，RHDV主要定位于感染細胞 的胞漿，感染后期，隨著(zhù)細胞壞死而進(jìn)入細胞核內。��[BT4]7.免疫�ト斯すザ局滤赖募彝�，經(jīng)肝、脾等臟器經(jīng)研磨成勻漿后，可甲醛或其它僅化學(xué)劑將病毒滅活 ，即為滅活疫苗，滅活疫苗具有良好的免疫效果，一般在接種后6～8天產(chǎn)生HI抗體，16～18 天HI 抗體滴度可達2����11��以上，以后緩慢下降。鋁膠苗的免疫期可達8～１０個(gè)月，油佐劑 疫苗的免疫期可達1年以上。滅活疫苗誘生干擾素的能力也很強，在注射油佐劑滅活疫苗后1 8小時(shí)，誘生的干擾素達高峰，血清中的干擾素效價(jià)在1∶200以上，疫苗的早期抗病毒作用 主要是通過(guò)干擾素發(fā)揮的。干擾素誘 生劑PolyI:C誘生的高水平干擾素亦有很強的抗RHDV能力，曾有報道，注射polyI:C6小時(shí)， 誘生的干擾素達到高峰，12小時(shí)后下降。10小時(shí)時(shí)用強毒攻擊，試驗兔100%被保護。�ケ粍�(dòng)免疫也有良好的預防和治療作用，肌肉注射高免血清0��2ml即可抵抗強毒攻擊。發(fā)病后 體溫升高時(shí)，立即用1ml高免血清治療，大部分病兔可被治愈。��[BT4]8.診斷�ネ贸鲅�癥大多數為最急性型和急性型，發(fā)病后精神沉郁，呼吸困難，很快死亡。 剖檢可見(jiàn)死兔營(yíng)養良好，全身血液循環(huán)障礙，實(shí)質(zhì)器官充血、出血，根據這些特點(diǎn)可作出初步診斷。確診則需經(jīng)實(shí)驗室檢查。��

(1)血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗�ノ⒘糠ê筒０宸ň�可。多數人習慣使用人的“O”型 紅細胞，但據楊漢春等報道，使用人的不同血型新鮮紅細胞所得結果無(wú)明顯差異。亦可將人的紅細胞通過(guò)高錳酸鉀固定后使用，此時(shí)HA或HI反應需在4℃進(jìn)行，因為在22℃和37 ℃反應時(shí)，固定的紅細胞易自凝。�パ�凝試驗(HA)用于檢出病、死兔 體內的病毒。病、死兔的肝臟或脾臟，研磨后加生理鹽水制成1∶5～1∶10的懸液，可以直接用于本試驗，具體操作方法參見(jiàn)本書(shū)第十四章。在本病流行初期，這些病料中的病毒血凝 效價(jià)可達10×2��1��3～10×2��1��8。玻板法用于現場(chǎng)檢疫，快速而簡(jiǎn)便，5分鐘即可得到 結果。出口的兔肉勻漿，凍融后用PEG濃縮50～100倍，離心取上清即可能用于兔肉中是否帶毒的檢測。HA試驗得到的結果應通過(guò)HI試驗確證。��HI試驗的特異性及敏感性都 很高，可用于 流行病學(xué)調查和疫苗免疫效果檢測，這種情況下多采用β法血凝抑制試驗術(shù)式；也可用于可疑病毒的血清學(xué)鑒定，此時(shí)多采用α術(shù)式，當陽(yáng)性血清能降低被檢病料血凝效價(jià)2個(gè)滴度以 上時(shí)，即為陽(yáng)性。

��(2)間接血凝試驗(IHA)��楊漢春用純化病毒，以戊二醛醛化綿羊紅細胞為載體，建立了間接血凝試驗，用以檢測抗體效價(jià)。其敏感性比HI高32倍，比AGP高1024倍。間接血凝抗原制備的最適條件：抗原濃度為1 ��5μg/ml,在37℃致敏1小時(shí)，最適反應溫度為37℃45min。��

(3)瓊脂擴散試驗(AGP)�コC正德等用病死兔肝臟乳劑制備的凍融抗原對感染病毒的兔血清進(jìn)行本試驗，檢出了沉淀抗體；戴康等發(fā)現以甲醛滅活制備的抗原與抗血清反應時(shí)，粗 提抗原可出現2～3條沉淀帶，高度提純的抗原則只出現一條帶。��

(4)酶標抗體技術(shù)�ネ鯁⒚鞯炔捎秒p抗體夾心法ELISA試驗快速診斷本病，結果與血凝試驗 具有良好的相關(guān)性，敏感性差別不大；潘榮生等應用雙抗體夾心法檢測冷凍兔肉產(chǎn)品中的RH DV，并與HA�睭I試驗對比，發(fā)現二者的敏感性相近，檢測骨髓樣品時(shí)的符合率為97��7%，檢 測肌肉樣品時(shí)的符合率為80��9%。酶標抗體染色法快速診斷本病的效果也很好：取病 死兔的肝臟或脾臟，觸片或制作冰凍切片，按常規法進(jìn)行固定，與抗血清和酶標抗體反應，在顯微鏡下觀(guān)察到特異性的感染細胞即可作出診斷。