電子顯微鏡技術(shù)的新發(fā)展

　　

  目前，用于生命科學(xué)研究的電子顯微學(xué)發(fā)展有兩個(gè)趨勢。一是向更微細的結構，生物分子和原子水平發(fā)展。電鏡已成為分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)非常重要的研究工具之一，用于細胞生物學(xué)、生物分子結構與功能關(guān)系以及抗原、抗體、蛋白質(zhì)、DNA定位等研究，例如對微管分子的研究、膜抗原的超微定位、膜抗原基因對核及細胞骨架系統蛋白質(zhì)組成的影響、細胞核內DNA、組蛋白、非組蛋白的分子觀(guān)察和定位以及核孔復合體識別蛋白質(zhì)的觀(guān)察等等，都取得了非常突出的進(jìn)展。另一個(gè)重要趨勢是向更普及的應用方向發(fā)展，如農林、醫藥、動(dòng)植物學(xué)等。在應用方面最引人注目的是病理診斷電子顯微學(xué)。它已成為一些病毒，如某些腫瘤和病毒病診斷上必不可少的工具。自從微波技術(shù)引入診斷電鏡學(xué)以后，病理樣品從取材到電鏡觀(guān)察只需2小時(shí)左右；免疫電鏡、電鏡組化等技術(shù)均已引入常規診斷學(xué)中�！�

　 1.掃描電鏡向高分辨率與低電壓方向發(fā)展。日本人Tanaka改進(jìn)了常規的掃描電鏡，設計了新型超高分辨率掃描電鏡UHS�睺1型，系統地改良了生物樣品的制備技術(shù)，關(guān)鍵是免除了金屬?lài)婂兊幕�本制樣過(guò)程，而用小而薄的樣品，使用“導電染色”，如用醋酸鈾水溶液浸染，以逐級乙醇脫水，在臨界點(diǎn)干燥，以“拋光的碳平板”(polishedcarbonplate)作為樣品的載體，在電壓15KV條件下可以獲得超高分辨的掃描電鏡圖像，達到優(yōu)于0��8nm的分辨力。不僅可以分辨出核糖體的大、小亞基，并可見(jiàn)到串連于諸多核糖體之間的mRNA的纖細絲狀結構，能看見(jiàn)DNA分子雙螺旋結構及其大溝與小溝。這一進(jìn)展令人鼓舞，它使生物大分子的三維圖像直接展現在人們眼前�！�

　 2.電鏡水平的原位核酸雜交為了提高核酸雜交的準確性與分辨力，不使用同位素放射自顯影技術(shù)而使用膠體金標記技術(shù)。電鏡原位雜交技術(shù)雖然早在1971年就開(kāi)始有報道，隨后不少科學(xué)家也進(jìn)行了許多嘗試，但都存在一個(gè)共同問(wèn)題，就是樣品精細結構保存的不好。直到1986年Binder等人用LowicrylK4M包埋樣品，切片后進(jìn)行雜交，才改進(jìn)和提高了雜交的效率和結構的保存。1987年Webster等用與Binder相似的方法檢測了細胞內mRNA的分布。Singer等則于1989年用雙標記原位雜交技術(shù)同時(shí)檢測細胞內與骨架結合的mRNA及其所表達的蛋白質(zhì)�！　�Erickson使用鏈親和素金標記物，以生物素標記cDNA為探針，多聚甲醛固定樣品1小時(shí)，以二甲基甲酰胺脫水，用LowicrylK4M樹(shù)脂包埋，在鎳網(wǎng)上進(jìn)行染色免疫反應�！　�

 3.高壓電鏡高壓電鏡主要用于兩個(gè)方面。一是由于高壓電鏡對薄樣品的輻射損傷小，因而可以獲得薄樣品的高分辨像；二是由于高壓電鏡的穿透力強，可以觀(guān)察厚樣品和含水樣品(如活體微生物和病毒等)。厚樣品如單層細胞，經(jīng)固定、染色和臨界點(diǎn)干燥后，結合立體觀(guān)察可研究完整細胞的三維結構及其與功能的關(guān)系，已有不少學(xué)者進(jìn)行了這方面的研究，并取得了一定進(jìn)展。含水樣品是放在高壓電鏡特制的充氣小室內進(jìn)行觀(guān)察的，雖已有人進(jìn)行了這方面的探索，但尚有不少技術(shù)問(wèn)題有待解決�！　�

 4.X射線(xiàn)顯微分析X射線(xiàn)顯微分析(X�瞨aymicroanalysis)是在電鏡基礎上發(fā)展起來(lái)的一項新技術(shù)。該技術(shù)特點(diǎn)在于：①既用電鏡觀(guān)察樣品的超微結構，又能分析其微小區域內的化學(xué)元素，為研究樣品的形態(tài)結構、組成成分與其生理功能的關(guān)系提供了條件；②可以分析小于1μm樣品中的元素，其靈敏度可高達10��-��1��5～10��-��1��8g，這是其它分析方法難以實(shí)現的。該技術(shù)所用儀器包括分析型電鏡、透射電鏡、掃描電鏡、掃描透射電鏡加X(jué)射線(xiàn)顯微分析裝置以及專(zhuān)門(mén)設計的電子探針等。它的原理是在電鏡內先以高速細電子束轟擊樣品表面的微小區域，使該區域所含元素各自發(fā)射出特征X射線(xiàn)，同時(shí)利用波譜儀(WDX)和能譜儀(EDX)查出特征X射線(xiàn)的波長(cháng)和能量，據此可以了解該區域內元素的種類(lèi)和含量�！　�X射線(xiàn)顯微分析生物樣品的制備最好運用冷凍制樣法。樣品經(jīng)液氮和低溫凍結后，可以保存細胞內的各種可溶性物質(zhì)和電解質(zhì)，有利于進(jìn)行細胞生理及生化功能的研究。冷凍制樣技術(shù)包括冷凍干燥、冷凍置換及冷凍超薄切片等�！　�

 5.電鏡細胞化學(xué)是將細胞化學(xué)和電鏡技術(shù)相結合的一項技術(shù)，是光學(xué)顯微鏡組織化學(xué)基礎上的延伸與發(fā)展。該技術(shù)是將特定反應產(chǎn)物形成電子散射力強的不溶性沉淀物，借助電鏡做超微結構的原位分析。由于細胞內酶分布和細胞超微結構二者密切結合，從而為探討細胞的生理和病理狀態(tài)提供了科學(xué)依據。此法無(wú)需對酶進(jìn)行提取和分離，就能獲得組織或細胞內有關(guān)代謝的大量信息，因此能將超微結構與功能反應有機地結合起來(lái)。目前，用該技術(shù)檢出的酶大約有80種，近40種可進(jìn)行超微結構定位。酶的電鏡細胞化學(xué)技術(shù)大致操作步驟為：化學(xué)固定或冷凍切片、溫育、鋨化、脫水、樹(shù)脂包埋、超薄切片、電子染色、電鏡觀(guān)察等�！　�

 6.掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡(scanningTunnelingMicroscopy,STM)是近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新型顯微鏡。STM利用量子力學(xué)中的隧道效應原理，可在原子尺度下研究物體表面的微觀(guān)結構和電子態(tài)。1983年首次用STM得到了Si(111)7×7重構表面的原子分辨圖像，為認識這個(gè)在表面物理中可能是最令人感興趣而又最復雜的表面奠定了基礎。STM不僅用于獲得原子結構和電子態(tài)等對基礎研究十分重要的信息，且已顯露出在微電子工業(yè)、表面微加工、電化學(xué)、催化、分子生物學(xué)工程等許多領(lǐng)域中的應用前景。據不完全統計，全世界已有千余臺STM�！　�STM的基本工作原理是讓一個(gè)有效尖端是原子尺度的針尖在壓電陶瓷管的驅動(dòng)下，由反饋回路控制在被研究物表面上方零點(diǎn)幾納米處掃描，以獲得表面信息。另外，由于隧道電流與針尖至樣品的距離是指數關(guān)系，它對針尖至樣品的距離改變極其靈敏(通常距離變化0��1nm，電流改變一個(gè)數量級)。這使得STM同時(shí)具有表面結構的實(shí)空間顯示特性和原子尺度的高分辨本領(lǐng)。目前橫向分辨本領(lǐng)可達0��1～0��2nm，深度分辨本領(lǐng)達0��01nm，放大倍數可達數千萬(wàn)倍。并且能直接給出三維圖像�！　�STM由于成像原理不同于透射電鏡，因而也突破了樣品必須處于真空中的限制。它既可在真空中工作，也可在大氣中甚至在液體環(huán)境中工作，這個(gè)特點(diǎn)特別有利于生物材料的研究，能夠克服生物樣品在真空中因脫水而產(chǎn)生的形變。此外，在STM中沒(méi)有高能電子束對樣品的作用，對樣品表面沒(méi)有破壞作用，從而避免了透射電鏡中高能電子對樣品的輻射和熱損傷。生物樣品，特別是生物大分子，極易受高能電子輻射的損傷，這種輻射損傷已成為透射電鏡研究生物大分子結構的頭等問(wèn)題。STM由于不需要任何光學(xué)透鏡和電子透鏡，體積小巧玲瓏，而又具有強大功能，所以獲得了口袋顯微鏡的美稱(chēng)�！　�1983年以來(lái)，已經(jīng)報道的用STM研究的生物Φ29噬菌體、生物膜、細菌細胞壁和DNA等�！　�DNA是生命遺傳信息的載體，研究其形態(tài)結構對分子生物學(xué)具有重大意義。同時(shí)，DNA具有結構上的均一性與恒定性，在形態(tài)上易于識別，這在一定程度上避免了STM觀(guān)察視野小(一般最大是幾微米)的內稟不足。盡管DNA的導電機制還不十分清楚，國外還是有一些實(shí)驗室用STM對DNA做了研究，并得到了令人振奮的結果�！�