5.懸浮樣品的免疫金標記
懸浮樣品的免疫金標記法，容易產(chǎn)生非特異性反應，這主要是抗原、抗體以及膠體金抗體比例不合適的緣故。作者在實(shí)驗中發(fā)現，應用高速離心法除去過(guò)量的抗原或抗體或膠體金抗體，不僅有助于除去非特異性反應，而且不會(huì )降低敏感性。其具體操作步驟：①取抗原(病毒液)50μl和相應的抗體(高免血清)50μl混合均勻；②置于37℃溫箱中作用1小時(shí)，加蒸餾水至滿(mǎn)管，以10000r/min速率離心30分鐘，棄上清；③將沉淀物用蒸餾水100μl懸��；④加50μl葡萄球菌A蛋白或第二抗體包被的膠體金溶液，混合均勻；⑤置于37℃溫箱中作用30分鐘；⑥加蒸餾水至滿(mǎn)管并以同樣速率和時(shí)間離心；⑦棄上清，取其沉淀物，用100μl蒸餾水將其懸浮，負染后電鏡觀(guān)察(圖12-23)。[HT5”SS] 圖12-23 免疫金標記的電鏡圖像(比例尺為100nm) 豬輪狀病毒粒子(箭頭) ——自李成等
6.快速包埋超薄切片
一般包埋方法需時(shí)較長(cháng)，大致需2～3天，甚至長(cháng)達1周左右，郝桂玉等建立了適于口岸動(dòng)物檢疫和臨床快速診斷病毒病的快速包埋方法：①固定，4％戊二醛固定10分鐘，1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH74沖洗數次，1％四氧化鋨固定10分鐘，PBS沖洗一次；②脫水，70％、95％、100％丙酮各5分鐘，內含無(wú)水硫酸鈉的100％丙酮換2次；③浸透，1份100％丙酮加1份包埋劑(Epon81270g、DDSA15g、MNA45g、DMP30按全量的2％加入)，在37℃溫箱中浸透10分鐘，純包埋劑混合物浸透10分鐘；④聚合包埋，用牙簽將樣品挑入膠囊或模具中，然后灌注適量包埋劑，置于95℃烤箱中，經(jīng)1小時(shí)聚合，待冷卻后切片，2％醋酸鈾水溶液染色2分鐘，枸椽酸鉛染色5分鐘，即可電鏡觀(guān)察。
7.微波輻射制樣
微波輻射制樣方法是將生物樣品的固定、脫水、浸透、包埋、染色等操作均在微波爐中進(jìn)行,予以一定“火力”和時(shí)間的微波輻射，從而加速制樣過(guò)程�！ �(1)微波輻射制樣技術(shù)的原理: 微波是一種非電離輻射的電磁波，其波長(cháng)在1mm至1m之間，用頻率為2450MHz(兆赫茲)。生物樣品中的一些雙極分子，如H2O、有極性側鍵的蛋白分子以及電荷不均一的其它任何分子，一旦暴露于電磁波的照射下，這些分子以180度的角度以每秒2450MHz的高速進(jìn)行轉動(dòng)與震動(dòng)，在短時(shí)間內組織內部便產(chǎn)生高熱，從而加速固定、包埋、染色，以及免疫反應、組化反應等的時(shí)間和提高制備質(zhì)量，利用家用微波爐即可在兩小時(shí)內制備出高質(zhì)量的包埋樣品供電鏡觀(guān)察。圖片的反差良好，精細度極高，染色沉淀很少。對包埋后的樣品進(jìn)行免疫金標記，亦可大大加速反應。通常利用在微波爐四周加水的方法來(lái)調節微波爐內的溫度，以免爐溫度過(guò)高破壞組織內的抗原性�！ �(2)微波輻射快速制樣技術(shù)的基本程序：現以國產(chǎn)蜆華牌家用微波爐為例來(lái)介紹。該儀器的功率為550W，并設有P1～P10共10個(gè)火力段�！ 、偃〔� 取新鮮材料，按超薄切片常規法進(jìn)行； �、诠潭� 將樣品置于25％戊二醛中，放入微波爐，在P1火力段下輻射15秒鐘作前固定，用磷酸緩沖液沖洗樣品3次，再用1％鋨酸液浸泡并放入微波爐中，于P1火力段下經(jīng)15秒鐘作后固定； �、勖撍� 在室溫下放置60秒鐘，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗3次(每次3分鐘)，用50～100％系列丙酮逐級脫水，每級脫水均在P1火力段下輻射1分鐘左右； �、芙� 先將樣品放入環(huán)氧丙烷中，在室溫下放置10分鐘，然后依次投入環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹(shù)脂1∶1和1∶2混合液中，在P1火力段下2分鐘；然后將樣品放入純環(huán)氧樹(shù)脂中，在P1火力段下3分鐘； �、莅� 將樣品置于配制好的包埋液中，并于周邊放一盛有300ml水的燒杯，在P1火力段下30分鐘，而后再移去周邊的燒杯，繼續在P1火力段下輻射30分鐘； �、耷衅� 與常規超薄切片法相同； �、呷旧� 鈾染色動(dòng)植物組織切片最佳輻射時(shí)間均為30秒；鉛染色動(dòng)物組織切片最佳輻射時(shí)間為30秒,而植物組織切片為20秒,染色液經(jīng)微波輻射后的溫度應控制在20～40℃�！ �(3)微波輻射制樣注意事項： �、�?lài)栏窨刂戚椛錅囟?微波輻射時(shí)固定液的溫度應控制在40～50℃之間為宜，否則易引起微波損傷，脫水時(shí)的溫度宜在20℃左右。為了掌握微波爐各功率段下各種溶液的不同溫度，最好在實(shí)驗前預先測定； �、趪栏裾莆蛰椛涔β� 制樣過(guò)程中每一步驟所使用的功率(火力段)不盡相同，但總的說(shuō)應以小功率輻射為主，而且在需要長(cháng)時(shí)間輻射時(shí)(如脫水、聚合和包埋)，最好采用低功率、間斷輻射的方式，這樣才能保存組織的超微結構；③在每步微波輻射之后，最好讓樣品在藥液中停留一段時(shí)間，以保證藥液滲入樣品并與組織充分結合； �、芪⒉t的廠(chǎng)家及型號不同，其功率大小和火力段的功率分配亦不相同，故實(shí)驗時(shí)應根據選用的微波爐來(lái)確定每一步驟用的火力段與輻射時(shí)間�！ �
8.免疫快速包埋超薄切片
某些情況下，單純用超薄切片法不能達到檢測病毒及抗原的目的，必須運用免疫標記方法才能達到目的。因此，將免疫標記與快速包埋超薄切片相結合，建立了免疫快速包埋超薄切片法。此法比常規超薄切片法快得多。免疫酶標記和免疫膠體金標記均可使用快速包埋或微波輻射包埋法,以提高鑒定病毒(抗原)的速度和準確性，更有利于臨床應用。
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