生物大分子主要包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類(lèi)。這些物質(zhì)在生命活動(dòng)中起著(zhù)重要作用，所以研究它們的大小、形態(tài)、空間結構以及各種存在形式，對了解其功能和在整個(gè)生命過(guò)程中的變化都具有重要意義。通常研究生命大分子多用兩種方法：一是用物理和化學(xué)方法測定其理化特性；二是用電鏡和X射線(xiàn)衍射技術(shù)觀(guān)察分析其形態(tài)及空間結構。X射線(xiàn)衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)結構研究方面雖然分辨率高達01nm，但只適用于能形成結晶體的樣品，局限性較大。而電鏡觀(guān)察的方法則比較簡(jiǎn)便，結果直觀(guān)可靠。雙鏈核酸分子01nm長(cháng)度的平均質(zhì)量為196左右，如果DNA的分子量為2×106Da，則其分子長(cháng)度可達1002nm，即1μm左右。由此看來(lái)，應用電鏡技術(shù)觀(guān)察和研究生物大分子結構不論其分辨率還是放大倍數完全可以達到目的和要求，當然這與樣品制備有著(zhù)密切關(guān)系。目前，應用電鏡技術(shù)研究最多的是蛋白質(zhì)和核酸兩大類(lèi)，其制樣方法如下�！ � 1.蛋白質(zhì)分子的電鏡樣品制備 由于蛋白質(zhì)樣品的電子散射能力很低，極易聚合成堆，所以制樣時(shí)必須設法增強其反差和進(jìn)行分散處理。蛋白質(zhì)分子從形態(tài)上可大致分為纖維狀和球狀兩大類(lèi)。纖維狀蛋白是由沿一個(gè)單軸平行排列的多肽鏈所組成，形成長(cháng)纖維或薄片，其性質(zhì)強韌、不溶于水，如動(dòng)物的膠原、角蛋白、彈性蛋白等；球狀蛋白的多肽鏈呈盤(pán)曲折疊，許多較大的蛋白質(zhì)都有二條或多條肽鏈，形成復雜的三級、四級結構。球狀蛋白多數溶于水，能結晶，如酶類(lèi)、血紅蛋白、抗體等。還有些蛋白質(zhì)則與其它組分結合成復合體，如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白(病毒)等。根據不同蛋白質(zhì)和不同的研究目的，所用的制備方法也不同，其制樣方法有負染、擬復型、金屬投影和超薄切片法等�！ �(1)負染色法：負染色是制備蛋白質(zhì)電鏡樣品最常用的方法，既適于游離狀態(tài)的單個(gè)分子，又適于蛋白質(zhì)結晶體。其制樣過(guò)程與常規負染法相同，但應注意以下幾點(diǎn)：①采用低噪音的碳膜，因為蛋白質(zhì)分子通常都很小，利用常規的有機膜在負染后會(huì )出現一些假象結構，容易造成誤判，因此最好采用低噪音的純碳膜，碳膜厚度以10～15nm為宜。②分離蛋白質(zhì)的溶液應有適當的濃度、離子強度和pH值，其濃度以5～10μg/ml為宜。如果濃度太低，觀(guān)察時(shí)難以尋找。濃度太高又易堆集，難以看清單個(gè)分子的結構。所用緩沖液濃度一般不超過(guò)2mmol/L，高濃度的鹽離子會(huì )在銅網(wǎng)膜上形成結晶，影響電鏡觀(guān)察。③負染色劑應選用具有較大惰性的、不會(huì )引起蛋白質(zhì)結構產(chǎn)生變化的試劑。常用的有磷鎢酸、鉬酸銨、硅鎢酸等。醋酸鈾也可用，但pH值大于6時(shí)就會(huì )發(fā)生沉淀④負染色操作，常用懸滴法或噴霧法。滴附后，載網(wǎng)需用雙蒸水進(jìn)行多次醮洗，洗去樣品中的鹽類(lèi)及雜質(zhì)，然后再進(jìn)行負染色。使用碳膜時(shí)，因為蛋白質(zhì)樣品不能均勻地吸附，必須先將碳膜用輝光放電裝置或靜電荷發(fā)生器或直接放在離子濺射儀中處理，使碳膜表面帶上一定量的靜電荷。有時(shí)將染液和樣品混合后再粘樣，往往也能使蛋白質(zhì)樣品較好地分散在支持膜上。應用噴霧方法時(shí)，將蛋白質(zhì)樣品和染液先混合，為了避免混合后蛋白質(zhì)溶液發(fā)生沉淀，要求染液的pH值不能接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)�！ �(2)云母擬復型法：利用噴霧法及新鮮剝開(kāi)的云母片表面的強親水性，可以解決蛋白質(zhì)分子分散難的問(wèn)題。但該法通常只能觀(guān)察分子的外形及大小，難以看到內部結構，分辨率也較低，但對一些纖維狀蛋白質(zhì)分子還是很有用的。具體制樣方法見(jiàn)本章的“金屬投影和復型”節�！ �(3)金屬投影法： 金屬投影法不僅能增強蛋白質(zhì)晶體的反差，而且能增加樣品表面的導電性，以便用電子衍射技術(shù)對晶體進(jìn)行分析研究。具體制樣方法按常規法進(jìn)行�！ �(4)超薄切片法：超薄切片法用于研究蛋白質(zhì)晶體樣品。對于一些體積較大，而且晶形較完整的結晶體，可以根據結晶學(xué)的規則來(lái)選擇特定的方向進(jìn)行切片，以便得到有關(guān)的結晶學(xué)參數。制樣按常規法進(jìn)行。如果結晶體很小，切片不易定向，也可通過(guò)分析許多隨機定向的切片之間的內在關(guān)系，來(lái)判定晶體的方向，推算出結晶學(xué)參數。例如，昆蟲(chóng)多角體病毒的包涵體是一種蛋白質(zhì)結晶體，通過(guò)超薄切片能了解它的晶格形式、取向和間距等資料�！ ‰婄R觀(guān)察的要求：①電鏡要有較高的分辨率，觀(guān)察蛋白質(zhì)分子樣品，需要把電鏡調至最佳狀態(tài)，精確合軸和消像散，準確調焦，消除樣品飄移等因素；②要盡可能減少輻射損傷，因為蛋白質(zhì)分子對電子束較敏感，長(cháng)時(shí)間的電子束照射，對樣品會(huì )產(chǎn)生損傷和污染，掩蓋微細結構。為此可采用如下措施：a.用“冷境”來(lái)冷卻樣品，并使用較小的束電流；b.選擇視野要迅速。調焦時(shí)，先對準近旁區域，調焦后再將需要的部位移到中央進(jìn)行照像；c.現代高性能電鏡上有最低輻射裝置(MDS)，以減小調焦時(shí)帶來(lái)的輻射損傷；d.還有的使用低溫樣品臺、低束流，配合圖像增強器，將掃描透射電鏡(STEM)運用于大分子的觀(guān)察等。 2.核酸分子的電鏡樣品制備根據核酸的結構和功能可分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA大都是長(cháng)鏈狀的雙螺旋分子(有部分病毒如細小病毒為單鏈DNA)，直徑為2nm。通常雙螺旋分子再進(jìn)一步盤(pán)繞折疊形成三級或四級結構；RNA大都是單鏈分子(呼腸孤病毒及雙鏈RNA病毒為雙鏈RNA)通過(guò)分子內堿基配對，形成“三葉草”狀的二級或三級結構。應用電鏡技術(shù)不僅可以觀(guān)察核酸分子的形狀和長(cháng)短，還可以區分是雙鏈還是單鏈，計算出分子量；通過(guò)一些特殊方法，還能分析異源雙鏈分子、雜交分子、轉錄復合體、核蛋白復合體等(如圖12-17)。從而為研究核酸的復制、轉錄，了解基因組的結構、基因片段的缺失、插入或倒置、基因定位以及堿基組成特征等，提供重要資料�！ ∮秒娮语@微鏡直接觀(guān)察核酸大分子，制樣技術(shù)上的關(guān)鍵問(wèn)題是如何克服反差弱和保持核酸分子在溶液中的構型。長(cháng)期以來(lái)主要采用蛋白質(zhì)單分子層技術(shù)，其中以Kleinschmidt方法應用較廣。此法利用球狀堿性蛋白在水溶液(或鹽溶液)表面形成不溶的變性薄膜。當蛋白溶液中含有核酸分子時(shí)(上相液)，帶有負離子的核酸分子被帶正離子的蛋白質(zhì)分子所包圍，蛋白質(zhì)在水溶液或鹽溶液(下相液)表面展開(kāi)成膜狀單分子層時(shí)，核酸分子也同時(shí)伸展成細絲狀的形態(tài)。 圖12-17 克隆的牛乳多空病毒核酸(橫杠=25nm)P表示質(zhì)粒區域，V表示病毒核酸區域，小箭頭指示處為單鏈區域，大箭頭指示處為異源雙鏈分子 ——自Campo等 (1)細胞包素C法：細胞色素C是最常用于這一目的的蛋白質(zhì)，以斜面法或微量法使其展開(kāi)成單分子膜�！ ∩舷嘁� 4mmol/LEDTA(pH75)125μl；24mol/LNH4Ac125μl。二者混勻后，加入25μlDNA溶液(DNA終濃度為05～10μg/ml)�；靹蚝�，取出5μl，后加入5μl細胞色素C(1mg/ml)�！ ∠孪嘁� 005mol/LNH4Ac�！、傩泵娣� 以直徑為10～15cm的干凈平皿或塑料盤(pán)，充滿(mǎn)下相液后，將干凈載玻片以30度角斜放在平皿中，溶液表面灑少量滑石粉，以觀(guān)察樣品展開(kāi)的區域。用微量注射器吸取上相液10～15μl沿玻片斜面滴入，上相液便沿玻璃斜面流下，推開(kāi)滑石粉在下相液上展開(kāi)成蛋白質(zhì)單分子層。約經(jīng)30秒鐘后，以覆膜的載網(wǎng)撈取樣品，然后以不同濃度的乙醇(25％、70％、99％)脫水或自然干燥。一般用鉑銥合金在7度角以20～30r/min旋轉噴鍍后，電鏡觀(guān)察。如果先用醋酸鈾酒精溶液(濃度為10-3～10-5 mol/L)染色30秒后再?lài)婂�，效果更好�！ 、谖⒘糠?將下相液4～5滴滴在聚四氟乙烯板上，然后用微量注射器在液滴表面輕輕加上相液5μl，靠液滴的表面張力將樣品展開(kāi)在水滴表面，經(jīng)2～3分鐘后，用覆膜載網(wǎng)撈膜，用不同濃度的乙醇(25％、70％、99％)脫水或自然干燥。一般用鉑銥合金在7度角旋轉噴鍍后電鏡觀(guān)察�！ ∪芤褐械暮怂岱肿与S溶劑、溫度與pH的不同，其所呈現的分子形態(tài)也有差異。在核酸結構中的各種化學(xué)鍵,受以上條件改變時(shí)影響最大的是各堿基之間相連的氫鍵。一般DNA總是以規則的雙螺旋結構形式存在。兩鏈中的堿基皆按AT與GC的關(guān)系配對。它們各自之間皆以氫鍵相連。因此DNA分子有一定的剛性，用上述方法制備DNA樣品容易獲得原有的結構圖象�！ �(2)甲酰胺法：由于RNA是單鏈分子，單鏈內的堿基�？上嗷バ纬蓺滏I而使分子聚集，在電鏡下成團出現，無(wú)法分清其真實(shí)的構型及變化。Davis(1971)在溶液中加入一定量的甲酰胺，解開(kāi)氫鍵，使RNA分子或DNA分子展開(kāi)成鏈的形態(tài)。展開(kāi)方法也是斜面法和微量法(如上所述)�！ ∩舷嘁� 40％甲酰胺中含05～10μg/mlDNA，005μg/ml細胞色素C，01mol/LTris，10mmol/LEDTA，pH85。配好后1小時(shí)內使用�！ ∠孪嘁� 30％甲酰胺中含10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH85。用前現配�！ �(3)甲胺鹽法：在用電鏡研究核酸與蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)，為了排除細胞色素C這一類(lèi)蛋白質(zhì)在觀(guān)察時(shí)產(chǎn)生的干擾，可用季銨鹽中的溴代十六浣基三甲胺(C16H33N＋Br-)或溴代十八烷基三甲胺(C18H37N＋Br-)代替細胞色素C，使核酸分子展開(kāi)。甲胺鹽類(lèi)的價(jià)格只是細胞色素C的1％左右�！ ∩舷嘁� 核酸分子濃度為1μg/ml，溴代十六(或十八)烷基三甲胺濃度為005mg/ml，甲酰胺濃度為492％，用02mol/LTris和29mmol/LEDTA作緩沖液調pH至85。下相液 無(wú)離子水�！ ∮弥睆�90mm的涂蠟玻璃平皿，倒入下相液后撒上少量滑石粉，用洗凈的載玻片以20度左右的傾斜角放在平皿上，用微量注射器吸4μl上相液滴在載玻片上，流至水面上即展開(kāi)成單分子膜，吸附在覆膜載網(wǎng)上，經(jīng)脫水或自然干燥后，用鉑銥合金旋轉噴鍍。
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