電鏡放射自顯影(electronmicroscopicradioautography)技術(shù)是電鏡技術(shù)與放射性自顯影技術(shù)相結合的一種新技術(shù)。它把靜態(tài)的形態(tài)學(xué)和動(dòng)態(tài)的生理功能的研究有機地結合起來(lái)。其原理是在含有放射性物質(zhì)的組織切片上，敷上一層感光核乳膠，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，從組織切片中放射出來(lái)的放射線(xiàn)使核乳膠中的溴化銀感光形成潛影，再經(jīng)過(guò)顯影處理，使在組織切片中的放射性物質(zhì)以銀粒的形式出現，通過(guò)肉眼、光鏡及電鏡觀(guān)察，研究該放射性物質(zhì)在組織切片中的分布及其數量等。該法已成為現代生命科學(xué)研究中的重要方法之一，并已得出一些非常有價(jià)值的資料，如生物大分子核酸、蛋白質(zhì)的合成和代謝研究，多糖類(lèi)和脂肪的合成和轉移定位，分子雜交結果的鑒定，酶分子定位，標記抗體對抗原的定位，激素和藥物的合成部位，病毒感染細胞中病毒復制過(guò)程的定位，宿主細胞中病毒基因的示蹤以及感染和未感染細胞新陳代謝的比較等等�！ ‰婄R放射自顯影的樣品制備程序： 放射性同位素標記[BH] ↓ 固定、包埋 ↓ 超薄切片 ↓ [] 鈾、鉛電子染色[][]噴碳膜(噴鍍儀內) ↓[][] ↓ 噴碳膜(噴鍍儀內)[][]敷乳膠膜(暗室內) ↓[][]↓ 敷乳膠膜(暗室內)[][]曝光(暗盒內4℃) ↓ [][] ↓ 曝光(暗盒內4℃) [][]顯影、定影(暗室內) ↓[][] ↓ 顯影、定影(暗室內)[] []鈾、鉛電子染色 [] [] ↓ 電鏡觀(guān)察 1.放射性同位素的標記 (1)放射性同位素的選擇：要考慮放射強度、半衰期以及使用劑量和曝光時(shí)間等因素。就β射線(xiàn)而言，能量低者比高者的感光效率高，分辨率也高，因此，如果其它條件相同，應盡量選用能量低的同位素。從感光效果、自顯影效率或分辨率考慮，選擇的順序是3H→14C→131I→32P。目前市售的大多數標記化合物都用3H來(lái)標記，它已成為該技術(shù)中最常用的同位素�！ �(2)放射性同位素標記化合物：包括研究DNA的有3H胸腺嘧啶核苷、3H放線(xiàn)菌素D；研究DNA的有3H尿嘧啶核苷；研究蛋白質(zhì)的有脯氨酸、精氨酸、亮氨酸以及氚標記的氨基酸等。放射性標記化合物雖可貯存，但它會(huì )產(chǎn)生輻射自分解。如要貯存，最好稀釋至所需的放射強度和濃度，以減少自分解。而且須貯存在黑暗處，尤其對不穩定的化合物，要在-140℃下貯放。一般的可在2～4℃冰箱內存放幾個(gè)星期不變質(zhì)。如需較長(cháng)期貯存，最好放在-100℃條件下，并須加1～3％乙醇作穩定劑和抑菌劑�！ �(3)使用劑量與曝光時(shí)間：對于超薄切片，要獲得滿(mǎn)意的結果必須有足夠的劑量。與光鏡的自顯術(shù)相比，劑量要大得多，電鏡放射自顯影為37×105～37×107Bq/g(10～100μCi/g)體重，細胞培養液中的放射性同位素的含量為37×103～37×107Bq/g(01～100μCi/ml}。為了縮短曝光時(shí)間，可加大投與量5～10倍。投與量與曝光時(shí)間成反比�！ �(4)標記方法：常用的有：①注射法，按所需的劑量在一定部位注入體內，完畢后防止外流，可用2％火棉膠封口；②灌胃法，即向胃中引入標記物質(zhì)；③澆灌飼喂法，用標記物質(zhì)處理土壤，讓植物吸收，再用該植物飼喂動(dòng)物；④涂抹法，將標記物質(zhì)涂抹在動(dòng)物體表，令其通過(guò)皮膚進(jìn)入體內；⑤培養法，向組織細胞培養液中加入一定比強度的放射性同位素，混勻，在37℃下培養，培養時(shí)間隨材料而定。培養后用生理鹽水洗滌，低速離心(1000r/min)5～10分鐘，棄上清，初步洗去多余的放射性物質(zhì)。加生理鹽水重新懸浮，再離心，棄上清，將其沉淀塊修成不超過(guò)05mm為宜�！ � 2.超薄切片 標記后的樣品，按常規法制備超薄切片。通常是按一定時(shí)間間隔陸續地取樣固定，以追蹤放射性同位素的轉運、代謝等變化過(guò)程�！ � 3.乳膠膜的制備 用于電鏡放射自顯影的核乳膠的直徑，理論上是越小越好，以提高分辨率。但當溴化銀顆粒的直徑小于50nm時(shí),其感光度顯著(zhù)下降，所以通常使用的核乳膠的直徑在200nm以下。目前常用的國產(chǎn)乳膠有HW3、HW4；進(jìn)口的有英國的HfordL4和日本的櫻花NRH2等�！ 『巳槟z在常溫下為半固體，使用前在暗室紅燈下先將其融化稀釋。按1∶1、1∶2、1∶4或1∶6加入雙蒸水，置熱水浴中加熱到40℃，約15分鐘，充分混勻。核乳膠的濃度越大，制備的乳膠膜上的銀粒就越密。稀釋后的乳膠用帶膜的載網(wǎng)沾一下，待干，用電鏡檢查銀粒是否重疊和留有空隙。合格后置于4℃冰箱中保存。最好是現用現配，否則本底增高，影響成像效果。制備單層乳膠膜常用方法： (1)套圈法: 用有機玻璃或金屬做一個(gè)與載網(wǎng)直徑相當的柱子。帶有切片的載網(wǎng)(切片朝上)置于柱子頂端。再用金或銀或鎳絲等做一個(gè)4mm直徑金屬環(huán)，燒結在玻棒上。將金屬環(huán)浸入乳膠中，垂直插入，輕輕提起，環(huán)內即形成一乳膠膜。再將膜輕輕地套在置于柱頂端帶切片的載網(wǎng)上。用鑷子把載網(wǎng)輕輕夾起，待干后置于暗盒中自顯影�！ �(2)浸涂法: 取一載玻片，充分洗凈晾干后，將一小塊雙面膠紙貼在載玻片的三分之一處，把帶有切片的載網(wǎng)放在膠紙上，切片面朝上，每張載玻片上可放2～4個(gè)載網(wǎng)。將載玻片慢慢浸入稀釋好的乳膠中，徐徐提起。用濾紙抹去載玻片背面的乳膠，垂直地置于無(wú)塵處，待干后放入暗盒中曝光�！ � 4.曝光 切片中的射線(xiàn)與乳膠中的溴化銀粒子相互作用的過(guò)程稱(chēng)為曝光或自顯影。通常在暗盒中進(jìn)行，盒內相對濕度控制在45～50％。密封后置于4℃冰箱中。一般需幾周到幾個(gè)月。準確估計曝光的時(shí)間不太容易，通常每隔一定時(shí)間(約二周)取樣作顯影試驗，直到效果滿(mǎn)意時(shí)，就全部結束曝光�！� 5.顯影和定影 通過(guò)曝光后得到的結果只能是潛影，必須經(jīng)過(guò)顯影和定影后才能觀(guān)察。顯影劑最好使用微粒顯影劑，以獲得較高的分辨率。常用的有D19或D19b，顯影溫度為15～20℃，顯影時(shí)間為2～4分鐘。值得注意的是，因顯影劑對已形成潛影的銀粒和未形成潛影的溴化銀晶體都能發(fā)生作用，使其顯影，只是前者速度快，后者速度慢。正確的顯影時(shí)間是前者剛好顯影清晰，后者還未顯影。如顯影時(shí)間不足，潛影不能充分顯示，時(shí)間太長(cháng)，會(huì )形成霧點(diǎn)和人為的假象。定影是將未形成潛影的溴化銀晶體溶去，留下還原的銀顆粒。常用的定影液是柯達F5�！ � 6.電子染色 為了增加自顯影樣品的反差也要進(jìn)行電子染色。其方法與常規超薄切片相同，也是用鈾和鉛染色。電子染色這一步既可放在敷加乳膠之前“先染”，也可在顯、定影之后“后染”。先染的優(yōu)點(diǎn)在于切片上沒(méi)敷乳膠層，所以在染色過(guò)程中不擔心引起銀粒移位和丟失。缺點(diǎn)是可能在染色中損失一些放射性物質(zhì)。為了防止染液中的某些基團與乳膠發(fā)生作用，在染色后都需噴鍍一層碳膜后再敷加乳膠。后染的優(yōu)點(diǎn)是能較好地保留切片中的放射性物質(zhì)，缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生染色沉淀物�！榱朔乐箻悠分械乃难趸~與乳膠顆粒作用導致潛影消退，通常在乳膠層與切片之間噴鍍一層碳膜。
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