免疫電鏡技術(shù)是把免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)有機地結合起來(lái)，使之兼有兩方面的特性，所以是研究抗原抗體相互作用的一種方法�？乖部贵w之間的相互作用是免疫化學(xué)反應的基礎，它具有高度的特異性，結合電鏡的高分辨能力和放大本領(lǐng)，可在超微結構和分子水平上研究各種組織和細胞內的免疫反應，并能精確定性、定位和半定量，使形態(tài)與機能緊密結合�！ ∧壳懊庖唠婄R主要分為有標記物和無(wú)標記物兩大類(lèi)。無(wú)標記物類(lèi)的常用方法為抗原抗體直接作用后形成的免疫復合物的電鏡觀(guān)察。有標記物類(lèi)，首先由Singer在1959年建立鐵蛋白(ferritin)標記抗體技術(shù)；由Nakane和Pierce在1968年建立酶標記抗體技術(shù)；由Faulk和Taylor在1971年建立膠體金標記技術(shù)。此外，還有雜交抗體技術(shù)(Hybridantibodymethod)和鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術(shù)(鐵蛋白抗體法)及凝集素(Lectin)電鏡標記技術(shù)等�！ � 1.抗原抗體免疫復合物(液相免疫電鏡法) 這種方法是用電鏡直接觀(guān)察抗原與抗體特異結合后形成的大分子復合物，具有簡(jiǎn)單易行、抗原和抗體用量少、在短時(shí)間內即可得出結果等優(yōu)點(diǎn)�？捎糜跈z出病毒或進(jìn)行病毒分型，并已用于臨床診斷。具體方法甚多，只介紹常用的幾種�！ �(1)離心法：①取含病毒的待檢樣品02ml、生理鹽水07ml和稀釋的已知抗血清01ml，充分混合。一般情況下可使用不作任何處理的抗血清。如將抗血清進(jìn)行40000r/min1小時(shí)離心和56℃30分鐘滅活等處理，或使用純化的抗體球蛋白，更可獲得良好的電鏡圖像。對于一定量的抗原，所用抗體的濃度與形成的復合物有很大關(guān)系�？贵w濃度太低或太高時(shí)，都不易形成大的抗原抗體復合物，所以要有適合的抗原、抗體比例�？寡宓南♂尶捎帽侗断♂尫�，也可用連續的10倍稀釋法。②置37℃感作1小時(shí)，然后4℃過(guò)夜�！ 、�10000～15000r/min離心30分鐘�！ 、苋ド锨�，將沉淀懸浮在少量緩沖液或餾水中，涂片，負染色后立即鏡檢。也可37℃感作后立即涂片，鏡檢�！ �(2)瓊脂濾過(guò)法：①和②與(1)相同，③制瓊脂板：吸取融化的08％瓊脂約15ml鋪在載玻片上，冷卻后備用。這種瓊脂板可冰箱保存數月。取一滴37℃感作后的抗原抗體復合物滴在瓊脂板上。隨即在復合物液滴表面放置覆膜的載網(wǎng)，使膜面向下漂浮在液滴上面。④經(jīng)一定時(shí)間后，液滴的液相漸漸擴散進(jìn)入瓊脂層內，液滴逐漸扁平，載網(wǎng)下降，當復合物液滴中液相基本擴散完時(shí)，即可攝取載網(wǎng)負染�！ �(3)瓊脂聚乙二醇法：這一方法是瓊脂過(guò)濾法的改良法，在瓊脂板下面加聚乙二醇吸水。具體步驟如下：①配制聚乙二醇溶液，取30g聚乙二醇(PEG4000)溶解在100ml水中，振蕩，使其完全溶解。②把濾紙折疊成約2mm厚半個(gè)載玻片大小，浸泡在聚乙二醇溶液中數分鐘，充分浸濕后取出烤干，放干燥器內備用。③制瓊脂板。取1g瓊脂糖放于100mlpH72的巴比妥緩沖液中加熱溶解，用吸管吸取約15ml瓊脂溶液均勻地鋪在干凈載玻片上，凝固后置濕盒中，冰箱保存待用。④用刀片切取適當大小的瓊脂板放在聚乙二醇紙片上，取一滴37℃感作后的抗原抗體復合物滴在瓊脂板上，立即用覆膜的載網(wǎng)面向下浮在液滴上，當液相剛被吸收完時(shí)，立即攝取載網(wǎng)負染�！ � 2.免疫標記電鏡 免疫標記電鏡技術(shù)是應用在電鏡下可見(jiàn)的標記物標記抗體(或抗原)，使標記抗體(或抗原)具有原標記物和抗體(或抗原)的特性，然后用標記抗體(或抗原)與相應的組織或培養細胞內特異抗原(或抗體)作用，形成不溶性免疫復合物，即在電鏡下可見(jiàn)的標記物，以間接證實(shí)免疫反應的發(fā)生。理想的標記物應具備下述四個(gè)條件：①標記物與抗體應等價(jià)(摩爾比1∶1)，而且穩定地相結合，結合物應具有標記物和抗體蛋白的雙重特征，結合物不與特異抗原之外的其它物質(zhì)形成非特異性結合。②標記物要盡可能小些。較大的標記物與抗體蛋白結合后，將使抗體蛋白的立體構造發(fā)生較大的改變，從而降低與抗原的結合力。同時(shí)，較大的結合物難于通過(guò)細胞的膜結構，不利于檢出細胞內的抗原。③在電鏡下，標記物最好呈細微顆粒狀，并具有足夠的電子散射力，使成像有足夠的反差。④抗原抗體標記物或抗原抗體抗抗體標記物反應后，其結合物在制片和觀(guān)察過(guò)程中不應移位或變性�！ ⊥耆珴M(mǎn)足上述條件的理想標記物至今尚未發(fā)現。目前常用的標記物有：鐵蛋白、辣根過(guò)氧化物酶、膠體金等�！ �(1)免疫鐵蛋白標記： 馬脾鐵蛋白為直徑11～12nm的球形顆粒，分子量650～900kDa，由蛋白質(zhì)外殼和鐵膠粒核心組成，核心直徑5～75nm。鐵膠粒含2000～3000個(gè)鐵原子，集中分布為四個(gè)小點(diǎn)，電鏡下為排列成菱形或方形的電子致密區，容易辨認。鐵蛋白標記多用于病毒或細胞表面抗原的定位�！ 、勹F蛋白的提取和純化： a.新鮮脾去除結締組織后剪碎加餾水(1500ml/Kg組織)，置組織搗碎器內制成勻漿�！ .將勻漿置水浴中加熱至78～80℃，使鐵蛋白以外的蛋白質(zhì)變性，然后用每平方厘米16目和100目的不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾或用四層紗布絞擠過(guò)濾。取濾液，7000r/min離心15分鐘。收獲棕紅色上清液，加固體硫酸銨(35g/100ml)，充分攪拌后置4℃過(guò)夜�！ .3000r/min離心30分鐘，棄上清，用餾水洗下沉淀，裝入透析袋，4℃餾水透析，除去鹽類(lèi)�！ .加2％硫酸銨，待溶后以4～5％的量加入固體硫酸鎘，置4℃過(guò)夜。此時(shí)出現大量鐵蛋白結晶，離心后即可獲得棕色的粗制鐵蛋白結晶�！ .將鐵蛋白結晶溶于少量2％硫酸銨中(pH585～59)，使溶液的蛋白質(zhì)濃度為1％，3000r/min離心15分鐘。每100ml棕紅色上清液加5g硫酸鎘，使重新結晶，置4℃2～3天。3000r/min離心15分鐘，取沉淀。如此重復5～6次，可得到高純度的蛋白晶粒�！ .將每100ml溶液得到的鐵蛋白結晶溶于75ml2％硫酸銨(pH585～59)，再加入等體積飽和硫酸銨，4℃過(guò)夜。3000r/min離心10分鐘，取沉淀。重復3次以上，除去鎘鹽。最后將硫酸銨沉淀物放4℃保存�！ .使用前，將沉淀物溶于少量餾水中，4℃對水透析，去掉硫酸銨后，再以01mol/LpH72磷酸緩沖鹽水透析6～8小時(shí)�！ 、阼F蛋白的鑒定： a.光學(xué)顯微鏡觀(guān)察：取少量鐵蛋白結晶體置載玻片上并加蓋玻片鏡檢。鐵蛋白晶粒為金黃色或棕黃色的四面體或八面體�！ .電鏡觀(guān)察：將濃度為500μg/ml的鐵蛋白水溶液直接涂在覆膜載網(wǎng)上鏡檢或負染后鏡檢，可看到典型的單個(gè)鐵蛋白分子�！ .聚丙烯酰胺凝膠電泳：75％聚丙烯酰胺凝膠電泳出現三條帶�！ 、坭F蛋白與免疫球蛋白的結合： 鐵蛋白與免疫球蛋白的結合，可用具有雙功能的異氰酸鹽類(lèi)化合物如二異氰酸間二甲苯(mxylylenediisocyanate,簡(jiǎn)稱(chēng)XC)、2,4二異氰酸甲苯(toluen2,4diisocyanate,簡(jiǎn)稱(chēng)TC)作為偶聯(lián)劑。使用這種偶聯(lián)劑形成的結合物往往顯著(zhù)降低抗體活力，這可能與偶聯(lián)劑的性質(zhì)及某些作用條件有關(guān)。近年來(lái)多采用戊二醛作偶聯(lián)劑，相比之下，對結合物的抗體活力影響較小，標記抗體的產(chǎn)量也高。用戊二醛作偶聯(lián)劑有一步法和二步法�！∫徊椒ǎ簩⒘蛩徜@沉淀的鐵蛋白對水和pH7201mol/LPBS透析后，按Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，使其濃度在25％左右。γ球蛋白的濃度為45％左右。按蛋白質(zhì)絕對量取鐵蛋白2份，γ球蛋白1份，混勻，然后加入1～2％戊二醛1/20份(戊二醛的最終濃度可為0005～005％)，攪勻后放37℃1小時(shí)，并不斷攪拌，再置4℃1小時(shí)�！ 刹椒ǎ涸诿抠裆齪H7001mol/LPB含50～80mg鐵蛋白的溶液中，加入稀釋的戊二醛，使其最終濃度為005～015％，總體積1ml，置37℃作用2小時(shí)。結合物經(jīng)葡聚糖G25過(guò)柱，除去未結合的戊二醛。然后加入γ球蛋白，使鐵蛋白的最終濃度為15mg/ml，球蛋白的最終濃度為3mg/ml。將混合液置37℃感作12小時(shí)(無(wú)需攪拌)，加入001mol/L賴(lài)氨酸中止反應�！ 》磻蟮漠a(chǎn)物有四種成分，即鐵蛋白標記抗體、未標記的γ球蛋白、未標記的鐵蛋白和剩余的戊二醛。后者可通過(guò)對緩沖液透析或通過(guò)凝膠柱(葡聚糖G25或G50)除去。未標記的抗體球蛋白會(huì )競爭性地占據標記抗體與抗原作用的位置，未結合的鐵蛋白會(huì )引起非特異性反應，必須盡量除去。純化方法有鹽析沉淀法和超速離心法。鹽析沉淀法是在結合液中緩緩加入1/3體積的飽和硫酸銨，使成25％的飽和度。此時(shí)，棕黃色的鐵蛋白標記抗體沉淀，未標記的抗體和游離的鐵蛋白仍留在上清中，4000r/min離心15分鐘，取沉淀物溶于少量01mol/L磷酸鹽緩沖液中，通過(guò)葡聚糖G25柱以除去硫酸銨，流速1ml/4分鐘，收集含有棕黃色的鐵蛋白標記抗體，對聚乙二醇透析濃縮。使用前測定蛋白質(zhì)含量，濃度范圍為10～18％�！ 〕匐x心法是將結合物經(jīng)100000g1小時(shí)離心3次，鐵蛋白標記抗體和游離鐵蛋白沉下，而未結合的抗體球蛋白則浮在上清中棄去。將沉淀懸浮在緩沖液中，結合鐵蛋白與游離鐵蛋白用電泳分離，超速離心回收�！ 】捎铆傊p擴散法對標記抗體進(jìn)行鑒定，用未標記的鐵蛋白和球蛋白混合物(按結合時(shí)的比例混合在緩沖液中)作對照。標記抗體產(chǎn)生的沉淀線(xiàn)呈棕黃色，于生理鹽水中浸泡數天不能漂去，以2％鐵氰化鉀酸性溶液染色，沉淀線(xiàn)變?yōu)槠蒸斒克{色�；旌衔飳φ找渤霈F沉淀線(xiàn)，沉淀線(xiàn)也呈棕黃色，但經(jīng)生理鹽水漂洗后棕黃色消失�！ 、茈婄R樣品制備： 電鏡樣品制備有直接法和間接法兩種。直接法簡(jiǎn)便易行，但敏感度低；間接法，制備一種標記抗抗體可用于多種試驗，敏感度亦高，故一般多采用間接法�！ ≈苯臃ㄊ菍⑴囵B細胞或組織經(jīng)緩沖液漂洗后與特異性鐵蛋白標記抗體作用，37℃1小時(shí)，用緩沖液充分漂洗，除去未結合的標記抗體。常規固定、脫水和包埋�！ ￠g接法是先用特異性抗體與被檢樣品結合，37℃感作1小時(shí)后離心去上清，以PBS洗數次后再與標記抗抗體37℃作用1小時(shí)，以PBS漂洗數次，除去未結合的標記抗抗體。以后過(guò)程與直接法相同�！ ≡谶M(jìn)行細胞內抗原定位時(shí)，可采取下述措施打開(kāi)細胞膜，增加細胞對標記物的通透性，然后再進(jìn)行免疫結合試驗�！ .凍融法。小塊組織或細胞經(jīng)5％福爾馬林或1％戊二醛短時(shí)間(約5分鐘)固定后凍融一次，使細胞膜破裂�！ .冷凍切片法。小塊組織短時(shí)間固定后,快速冷凍,切成10～15μm左右厚度的薄片�！ .樣品經(jīng)戊二醛短時(shí)間固定后，以4×10-5mol/L洋地黃皂苷處理1分鐘�！ 榕懦翘禺愋�，必須進(jìn)行對照實(shí)驗。一般設下面幾種對照：(a)正常組織或培養細胞對照；(b)樣品先用未標記的特異抗體處理，然后再用標記抗體處理；(c)標記抗體先與特異抗原作用，再與樣品作用；(d)用非特異性標記抗體處理樣品等。上述4組對照都應呈現陰性結果�！ �(2)免疫酶標記: 免疫酶標記技術(shù)(immunoenzymatictechnique)是以酶為抗原抗體反應的標記物，它必須不改變抗原、抗體的免疫反應特異性，也不降低酶活性，而且與相應底物作用后形成不溶性的反應物。其結果是：光鏡下為有色的可觀(guān)察性終末產(chǎn)物，電鏡下為電子散射力強的終末產(chǎn)物(圖12-15)。用于免疫電鏡標記的酶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AKP或ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、葡萄糖氧化酶(GOP)等。目前最常用的是HRP�！ ∶庖唠婄R技術(shù)對HRP的純度要求高，一般使用Rz30以上者為好，而商品酶往往低于此值，在實(shí)驗前要對Rz低于30的酶進(jìn)行純化�！ ∶笜擞浛贵w的制備方法甚多，免疫電鏡技術(shù)多采用戊二醛二步法。有關(guān)電鏡樣品制備的間接法介紹如下： �、偃〔� 如為單層細胞培養物，可先傾去培養液，用緩沖液洗1次后刮下貼壁細胞，離心成細胞小塊。如為組織，則需快速冷凍切片(切成約10～15μm厚的切片)，融化后置離心管內離心成細胞小塊。離心后傾去上清，加適量過(guò)碘酸賴(lài)氨酸多聚甲醛(PLP)固定液或者戊二醛多聚甲醛固定液固定。單層細胞于4℃固定05～1小時(shí)，組織則于4℃固定2～4小時(shí)�！ 、诳贵w球蛋白感作 傾去固定液，用PBS洗3次，每次10分鐘，洗去剩余的固定液。然后加入適當稀釋的抗體球蛋白，37℃或室溫感作2～4小時(shí)。感作后用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10分鐘，洗去未結合的抗體球蛋白。用25％戊二醛固定15～30分鐘后傾去固定液，用PBS洗3次，每次10分鐘，去掉剩余的戊二醛�！ 、蹣擞浛贵w(抗抗體)感作 加入酶標抗抗體，37℃或室溫感作2～4小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10分鐘，洗去未結合的酶標抗體。用25％戊二醛固定15～30分鐘，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10分鐘，洗去剩余的戊二醛�！ 、茱@色 用005mol/L，pH76TrisHCl緩沖液洗5分鐘，傾去緩沖液。加入顯色液(取75mg3,3二氨基聯(lián)苯胺溶于100ml005mol/L，pH76TrisHCl緩沖液內，臨用前取所需量，于每ml中加1μl30％H2O2，使H2O2的最終濃度為003％)。室溫避光顯色15～30分鐘后，再以TrisHCl緩沖液洗數次。加入適量1％鋨酸固定液室溫固定1小時(shí)，餾水洗去剩余的固定液�！ 、莩Ｒ幟撍�、包埋、切片 不染色直接鏡檢。 [HT5”SS]圖12-15 牛白血病病毒感染羊胎肺細胞的辣根過(guò)氧化物酶標記的免疫電鏡圖像 箭頭所指的是被辣根過(guò)氧化物酶標記的病毒粒子，比例尺為200nm ——自李成等[HT5SS] (3)免疫膠體金標記: 免疫膠體金標記技術(shù)又稱(chēng)免疫金染色技術(shù)(immunogoldstainingtechnique)，是利用膠體金(colloidalgold)在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，使其與抗體相吸引，從而將抗體標記，制成免疫膠體金以研究抗原-抗體的關(guān)系，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項新技術(shù)(圖12-16)。 [HT5”SS]圖12-16 牛白血病病毒感染羊胎肺細胞的免疫金標記的電鏡圖像 箭頭所指是被膠體金標記的病毒粒子，比例尺為100nm ——自李成等 氯化金(又名氯金酸，HAuCl4)水溶液在還原劑作用下形成的金顆粒，在顆粒之間因靜電作用而互相排斥，保持一個(gè)較穩定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金具有高電子密度和其表面能結合生物大分子的特性。Faulk和Taylor于70年代初首先應用膠體金作為透射電鏡探針研究了沙門(mén)氏菌細胞壁表面抗原的分布。近年來(lái)，該技術(shù)幾經(jīng)改進(jìn)，現已廣泛應用于免疫組織化學(xué)和細胞化學(xué)等方面。該技術(shù)把免疫學(xué)中抗原抗體反應的高度特異性、敏感性與組織化學(xué)中形態(tài)的可見(jiàn)性有機地結合起來(lái)，可以在組織、細胞、亞細胞及分子水平上研究免疫作用。在透射電鏡領(lǐng)域內，該技術(shù)已成功地應用于標記病毒、細菌、紅細胞、骨髓細胞、淋巴細胞、血小板、腎細胞、肝細胞、神經(jīng)元、垂體組織、十二指腸等的抗原和大分子方面的研究。目前應用膠體金單克隆抗體技術(shù)研究病毒結構，更精確地將結構與功能有機地結合起來(lái)。該技術(shù)是當前在生物學(xué)研究中比較理想的標記技術(shù)，介紹如下�！、倜庖吣z體金標記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) a.膠體金是一種粒性標記物，具有較精確的定位能力，對超微結構的分辨影響較小，最小的粒子能在高分辨電鏡下觀(guān)察。此點(diǎn)優(yōu)于酶標，因酶標產(chǎn)生彌散、形態(tài)不整的產(chǎn)物，往往會(huì )影響被標記物結構的觀(guān)察； b.膠體金具有比鐵蛋白更高的電子密度，它不易與動(dòng)物機體內存在的鐵蛋白及其產(chǎn)物相混淆； c.膠體金比其他標記物制備簡(jiǎn)易，只要有精確的試劑濃度、pH值和離子強度，就容易生產(chǎn)出好的產(chǎn)品； d.包被后膠體金顆粒的非特異性吸附比其他標記物低； e.膠體金顆粒具有較高的電子密度，因此具有較好的發(fā)射二次電子的能力，此點(diǎn)可用于掃描電鏡觀(guān)察； f.膠體金具有顏色反應，可用于光學(xué)顯微鏡觀(guān)察； g.采用不同還原劑以及通過(guò)劑量的控制可制成不同粒徑(3～150nm)的膠體金顆粒。小顆�？稍诟叻直媛实乃缴线M(jìn)行觀(guān)察，同時(shí)由于其顆�？臻g位阻小，能更多的結合特異部位而提高敏感性；應用大顆粒膠體金標記，可在較低分辨率的水平上進(jìn)行透射、掃描電鏡觀(guān)察；應用不同大小的膠體金顆粒同時(shí)標記一個(gè)樣品，可用于多標記研究。②免疫膠體金標記技術(shù)程序 a.膠體金的制備 枸椽酸三鈉還原法 取001％HAuCl4水溶液100ml加熱至沸騰，迅速加入1％枸椽酸三鈉水溶液4ml，約5分鐘后出現橙紅色，所制備的膠體金粒徑約15nm，如將枸椽酸鈉的量分別減至15、10或075ml，則膠體金的粒徑分別增至約30、50或60nm�！ 】箟难徇�原法 將預冷至4℃的1％HAuCl4水溶液1ml、02mol/LK2CO3水溶液15ml、雙蒸水25ml混勻后，在磁力攪拌下加入07％抗壞血酸水溶液1ml，混合后立即呈紫紅色，隨后加入雙蒸水至100ml，加熱至溶液呈紅色。此法制備的膠體金粒徑為8～13nm�！ “琢走�原法 將雙蒸水120ml、1％HAuCl4水溶液15ml與01mol/LK2CO3水溶液27ml混合，在緩慢攪拌中快速加入白磷乙醚溶液(附1)1ml，在室溫中慢速攪拌15分鐘，然后置100℃水浴30分種，貯存備用。此法所制備的膠體金粒徑為5～12nm。鞣酸枸椽酸鈉還原法 將1％HAuCl4水溶液1ml加入雙蒸水79ml中混勻為A液；另將1％枸椽酸鈉4ml、1％鞣酸07ml及01mol/LK2CO3水溶液02ml混合，加雙蒸水至20ml為B液。二者同時(shí)加熱至60℃，在磁力攪拌下將B液迅速加入A液中，繼續加熱攪拌至溶液呈亮紅色。此法所得膠體金粒徑為5nm。如將1％鞣酸用量變?yōu)?01～4ml時(shí)，則粒徑可從15nm減至33nm。若需制備5nm左右的膠體金，最好應用鞣酸枸椽酸鈉還原法，此法所制備的金顆粒較均勻，而應用白磷法毒性較大，一般情況不用。b.膠體金抗體的制備(膠體金包被)膠體金對第二抗體(IgG)或葡萄球菌蛋白A(SPA)的吸附取決于其pH值，在接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)或略偏堿的條件下，二者容易形成牢固的復合物，如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，則會(huì )聚集而失去結合能力。膠體金的pH值可用01mol/LK2CO3或01NHCl液調至待結合蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或略偏堿(IgG的pH為90，單克隆抗體的pH為82，親和層析抗體的pH為76、SPA的pH為59～62)為宜�！ ∈紫日页瞿z體金和第二抗體(IgG)或SPA最適結合比例，即用第二抗體或SPA(含量為1～2mg/ml)50μl，以0005mol/LNaCl倍比稀釋?zhuān)謩e于每一管中加入膠體金250μl，５分鐘后，各管再加10％NaCl液250μl，即可觀(guān)察到顏色改變。以沒(méi)有顏色改變的最高稀釋度作為膠體金和第二抗體或SPA結合的最適比例濃度。應用時(shí)再多加10～20％的抗體，以穩定蛋白質(zhì)的實(shí)際用量�！ ≈苽淠z體金抗體時(shí)，按上述比例和要求，分別取所需量的膠體金及相應量的第二抗體或SPA，在磁力攪拌下將膠體金溶液加入第二抗體或SPA液中，10分鐘后加入3％聚乙二醇(分子量為20000)至最終濃度為005％,以進(jìn)一步穩定包被后的膠體金�！ .膠體金抗體的純化 為了除去其中未結合的第二抗體或SPA及未充分穩定的膠體金和各種可能形成的聚合物，常用超離心法、凝膠過(guò)濾法純化，但最常用的是超離心法。該法是在裝好液膠的離心管底層加5％甘油005％聚乙二醇002％疊氮鈉溶液2ml作墊層，經(jīng)120000g離心1小時(shí)，液膠最后濃縮在其管底部呈暗紅色(緊貼管壁的圓形液膠塊不要收集，收集時(shí)應避免上清液混入液膠中)。收集的液膠可以濃縮或稀釋成原體積的10倍，4℃保存�！.應用膠體金抗體進(jìn)行細胞抗原標記方法 包埋前的標記法 以選用粒徑約5nm的膠體金為例。首先將被病毒感染的組織或培養細胞用1％多聚甲醛002％皂素0025％戊二醛液固定1小時(shí)(4℃)，然后用05mol/LTBS(pH74)溶液(附2)洗30分鐘，加適當稀釋的相應高免血清(第一抗體)于室溫作用30分鐘后，4℃過(guò)夜，以002mol/LTBS(pH82)溶液(附3)洗2～3小時(shí)，加適當稀釋的膠體金抗體，于室溫作用30分鐘，4℃過(guò)夜(最好在輕微攪拌下)，用002mol/LTBS洗5次以上，持續數小時(shí)(伴有輕微振動(dòng))。以后各步驟(戊二醛、鋨酸固定、脫水、包埋、切片、鈾鉛雙染色及電鏡觀(guān)察)按常規進(jìn)行�！ 〕∏衅髽擞浄� 該法通常是在冷凍切片、低溫包埋切片或常規包埋切片后進(jìn)行。后標記的優(yōu)點(diǎn)是可以標記細胞中任何部位的抗原成分，對細胞的超微結構和功能生物大分子的發(fā)生、分布和相互作用的研究都很有意義�！ .常規包埋切片的免疫染色法步驟 超薄切片80nm左右(也可5～70nm)，置于無(wú)支持膜的300～400目鎳網(wǎng)(或銅網(wǎng))上； 置1～10％H2O2液中處理10分鐘～1小時(shí)，視環(huán)氧樹(shù)脂硬度和切片厚度而定，(環(huán)氧樹(shù)脂越硬，需H2O2濃度越高)，以除去鋨酸和增進(jìn)樹(shù)脂的穿透性，利于抗體進(jìn)入；雙蒸水洗3次，每次5～10分鐘；浮于正常羊血清(1∶50～1∶100)滴上，室溫30～60分鐘；PBS(內含1％牛血清白蛋白,pH82)中漂洗5分鐘；加適當稀釋的膠體金標記抗體液(1∶30～1∶100)，淡紅色為適宜稀釋度，置4℃20小時(shí)或室溫10～120分鐘；雙蒸水洗3次，每次3分鐘；醋酸鈾和枸椽酸鉛電子染色，待干后電鏡觀(guān)察�！ .LowicrylK4M低溫包埋切片的染色步驟 1％BSA室溫孵育30分鐘；第一抗體作用，于4℃過(guò)夜或室溫2小時(shí)；水洗，用PBS洗3次，每次10分鐘；蛋白A膠體金(PAG)在室溫作用1小時(shí)；水洗，用PBS洗1次，雙蒸餾水洗1次；電子染色，用醋酸鈾和枸椽酸鉛液按常規法染色。g.膠體金抗體對病毒懸浮樣品的標記方法 吸取病毒懸浮液10μl，滴在蠟盤(pán)上，將載膜的銅網(wǎng)膜向下放在懸滴上，經(jīng)10～15分鐘吸附，多余的液體用濾紙吸干；吸取適當稀釋的相應抗血清(第一抗體)10μl滴在蠟盤(pán)上，將載樣品的銅網(wǎng)放在液滴上，感作約2分鐘；用015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH72)沖洗5次；吸取膠體金第二抗體10μl滴在蠟盤(pán)上，將上述沖洗后的銅網(wǎng)放在膠體金液滴上，經(jīng)3～15分鐘感作；用上述磷酸鹽緩沖液沖洗6次，雙蒸水沖洗2次，用濾紙吸干；用2％磷鎢酸(pH65)負染色約30秒鐘，用濾紙吸干，電鏡觀(guān)察。h.操作中幾個(gè)需要討論的問(wèn)題 包被后的膠體金凝集現象，是該濾液中含鹽成分過(guò)多之故。一般情況下，蛋白質(zhì)大分子應當在無(wú)鹽或極低鹽濃度的環(huán)境中。另一方面，液膠的pH值對凝集也有很大關(guān)系，應調整到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)或略偏堿一點(diǎn)的范圍，每一步驟的沖洗液也應符合所沖洗物的pH值。非特異性反應問(wèn)題，應注意以下幾點(diǎn)：第一抗體及膠體金抗體應稀釋到最佳稀釋倍數；抗體成分要純；在操作步驟中沖洗要充分，尤其分別在第一抗體和膠體金抗體感作之后，一定要徹底沖洗，以除去未作用的反應物；由于包被后的膠體金溶液中含有未結合的多余蛋白質(zhì)(第二抗體)，而這些蛋白質(zhì)的分子量比包被后的膠體金抗體小，因此，在與第一抗體抗原復合物結合中，它搶先占據了抗原(第一抗體抗原復合物)結合的位置，使膠體金抗體相對地減少了結合的數量，所以在電鏡下，在有些抗原位置上本應有膠體金存在，卻看不到膠體金標記現象。關(guān)于膠體金穿透性問(wèn)題，盡管在標記過(guò)程中為了增加細胞膜的通透性，加了皂素，但效果仍不理想。在細胞內的抗原位置和抗原集團內部仍很難發(fā)現膠體金標記現象。有人用冷凍斷裂超薄切片法進(jìn)行膠體金細胞內抗原定位，增加了細胞內部的通透性�！ 「�1：白磷溶液制備 在水中將白磷切成小塊，用鑷子快速投入約20ml乙醚中使達飽和狀態(tài)，輕輕搖動(dòng)至少2小時(shí)后，取上清液，以4800g離心20分鐘，吸取上清液用乙醚稀釋5倍，立即使用(注意，凡含有白磷的剩余物要用適量硫酸銅溶液破壞其毒性后方可倒掉)�！ 「�2：005mol/LTBS(pH74)溶液配制 Tris(三羥甲基胺基甲烷) NaCl 蒸餾水121g175g1500ml[FL)] 在磁力攪拌下滴加濃HCl至pH74，再加蒸餾水至2000ml�！ 「�3：002mol/LTBS(pH82)溶液的配制 Tris NaCl 牛血清白蛋白(BSA) NaN3(疊氮鈉) 蒸餾水484g175g20g10g1500ml 在磁力攪拌下用濃HCl滴至pH為82，再加蒸餾水至2000ml。
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