冷凍超薄切片技術(shù)是在光學(xué)顯微冷凍切片和電鏡超薄切片的基礎上發(fā)展起來(lái)的。由于常規超薄切片技術(shù)中應用化學(xué)固定、有機溶劑脫水、樹(shù)脂包埋等一系列處理，均可使生物樣品受到物理和化學(xué)性損傷，引起組織和細胞內蛋白質(zhì)分子變性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物質(zhì)被抽提或發(fā)生移位。為了彌補這些缺陷，人們創(chuàng )造了冷凍超薄切片技術(shù)。70年代后，出現商品冷凍超薄切片裝置，使該技術(shù)有了更大發(fā)展。目前，此技術(shù)可在分子水平上研究新鮮生物樣品的超微結構、各種生物大分子和某些元素在細胞內的分布狀態(tài)，并在細胞化學(xué)、免疫電鏡、X射線(xiàn)微區分析及可溶性物質(zhì)放射自顯影研究等方面發(fā)揮巨大作用�！ ±鋬龀∏衅夹g(shù)主要操作程序： 1.樣品預處理冷凍超薄切片樣品的預處理，包括兩種方法:一種是樣品直接冷凍固定，該法有利于保存生物樣品中可溶性物質(zhì)及生物大分子的活性、天然構型和保持元素的分布狀態(tài)，主要用于生物樣品內可溶性物質(zhì)的放射自顯影和X射線(xiàn)微區分析；另一種是對樣品先采用戊二醛固定、冷凍保護劑浸泡等預處理，此法適用于細胞化學(xué)、免疫電鏡等超微形態(tài)學(xué)研究�，F將后一種方法介紹如下：(1)取材,為了保證制樣效果，樣品塊越小越好，以小于1mm3為宜(直接冷凍法也相同)；(2)固定,用01mol/L二甲胂酸鈉緩沖液(pH72)，將戊二醛配成25％的溶液，把取材后的樣品塊放入該溶液中固定15～60分鐘。依實(shí)驗材料和研究目的不同，固定液的濃度及固定時(shí)間可適當改變。如用1％戊二醛固定5分鐘，可較好保存心肌線(xiàn)粒體嵴上球狀蛋白質(zhì)的構形；用02％戊二醛固定15分鐘(4℃)，適于細胞內抗原的免疫鐵蛋白標記的研究；(3)冷凍保護處理,當樣品冷凍時(shí)，其細胞內液開(kāi)始凝固時(shí)的溫度，稱(chēng)為“冷凍點(diǎn)”，含水量80％的細胞約為-30℃。經(jīng)逐漸冷卻，水份就慢慢形成冰晶。如果冰晶太大就會(huì )使細胞變形移位，但到低于-80℃的超冷凍期時(shí)，就發(fā)展到“再結晶點(diǎn)”。超過(guò)此點(diǎn)以后，就不形成冰晶。冷凍的細胞內液成為均勻的玻璃狀。冷凍保護劑的作用是為了提高細胞內液的濃度，降低冷凍點(diǎn)，從而減少冰晶形成。常用的冷凍保護劑有20～30％甘油、06～23mol/L蔗糖、20％二甲基亞砜(DMSO)、5％聚乙烯醇溶液等。處理時(shí)間從幾分鐘到幾小時(shí),一般認為甘油溶液是比較理想的防凍處理液，因為它具有潤濕劑的作用，有利于負染色液的鋪展與染色。 2.快速冷凍固定冷凍超薄切片質(zhì)量的好壞直接決定于快速冷凍效果。常用的快速冷凍方式有二：一是液氮直接冷凍；二是金屬接觸冷凍。后一種方法較好，即將銅塊先置于液氮中，待溫度平衡后，將樣品與銅塊接觸5～10秒鐘，以達到快速傳導降溫的目的，然后再將樣品置于液氮中待用。 3.切片 (1)冷凍超薄切片機：該機是在固有型超薄切片機基礎上附加低溫操作裝置組成的。常用的機型是配以L(fǎng)KBCryoKit冷凍裝置的瑞典LKBⅢ型(或Ⅴ型)超薄切片機。該裝置包括：冷凍室、冷凍刀臺、冷凍樣品頭、存放液氮的杜瓦瓶及溫度和液氮水平控制器等。冷凍室是一個(gè)具有絕緣性能的塑料箱。它將冷凍刀臺和冷凍樣品頭罩在其內。刀臺、樣品頭分別有管道與杜瓦瓶相通，并通過(guò)管道不斷向它們輸送液氮；在刀臺和樣品頭內有溫度傳感器及加熱裝置，有盛致冷劑的容器，容器內還有致冷劑水平感受器。當用液氮作致冷劑時(shí)，其樣品頭溫度可控制在-70℃～-170℃，刀溫控制在-70℃～-150℃。溫度傳感器是由溫度及液氮水平控制裝置進(jìn)行自動(dòng)調節,其調節過(guò)程是向刀臺和樣品臺的致冷劑容器中灌滿(mǎn)液氮。若將控制裝置的溫度選擇在-100℃的位置，刀臺和樣品頭的溫度下降到-100℃以下，則傳感器即給控制裝置發(fā)出溫度下降的信息，控制裝置即可通過(guò)加熱器產(chǎn)生補償的加熱電流，使刀臺與樣品頭的溫度保持在-100℃的狀態(tài)。在切片過(guò)程中，由于液氮的不斷消耗，致使容器中的致冷劑不斷減少而液面下降，容器中的白金電阻器可感受液氮量的變化。當液面低于預定標準時(shí)，白金電阻器即可引起杜瓦瓶中的加熱器工作以提高瓶中的壓力，使瓶中的液氮向致冷劑容器中流動(dòng)，直至容器中的液面又恢復到原來(lái)的水平為止。(2)切片操作：①向刀臺和樣品頭的致冷劑容器中倒入液氮，使冷室的溫度達到穩定的低溫狀態(tài)；②安裝冷凍的樣品頭、玻璃刀(或鉆石刀)，調整刀與樣品的距離，調好溫度及液氮水平控制裝置；③自動(dòng)切片，冷凍超薄切片的具體方法有以下兩種：一是濕刀法，即用液槽法。切片槽里的液體需在低溫下不凍結的液體，如二甲基亞砜、甘油、乙烯乙二醇、異戊烷等。當用二甲基亞砜時(shí)，其6％的水溶液在-60℃時(shí)可不結凍。切片時(shí)樣品的溫度常為-60℃～-80℃，刀溫高于樣品溫度10～20℃為宜。其操作與常規超薄切片法相同，但宜放慢切片速度；二是干刀法，即不用液槽法，而用滴管上的飽和蔗糖液滴，粘起玻璃刀上的切片，然后將凝固的蔗糖液滴從冷凍室里移出，在室溫下待蔗糖融化后，利用其表面張力使切片展平，并放在附有支持膜的載網(wǎng)上，用雙蒸餾水洗去蔗糖后染色。但亦有人用注射器吸取30％甘油或二甲基亞砜液滴的方法，同樣獲得滿(mǎn)意效果。 4.染色冷凍超薄切片可采用正染色或負染色。一般的形態(tài)學(xué)觀(guān)察和超微結構研究，用負染色法為好。該法簡(jiǎn)單快速，有利于保存結構和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。常用的負染色劑有磷鎢酸(02～1％,pH65～85)、醋酸鈾(05～3％,pH45～52)等，染色時(shí)間為5～60秒。如用正染色，應考慮到冷凍切片沒(méi)有包埋介質(zhì)支持，因此切片非常脆弱，須倍加小心操作。
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