冷凍蝕刻(Freezeetching)技術(shù)是從50年代開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的一種將斷裂和復型相結合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，故而亦稱(chēng)冷凍斷裂(Freezefracture)或冷凍復型(Freezereplica)。它的優(yōu)點(diǎn)在于：①樣品通過(guò)冷凍，可使其微細結構接近于活體狀態(tài)；②樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀(guān)察到不同劈裂面的微細結構，進(jìn)而可研究細胞內的膜性結構及內含物結構；③冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復型膜，具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長(cháng)期保存。它的缺點(diǎn)是：冷凍也可造成樣品的人為損傷；斷裂面多產(chǎn)生在樣品結構最脆弱的部位，無(wú)法有目的地選擇。目前，冷凍蝕刻裝置的型號很多，但主要分為兩種類(lèi)型：一種是專(zhuān)用冷凍蝕刻裝置，如EIKO公司生產(chǎn)的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生產(chǎn)的BAF300型；另一種是真空噴鍍儀的冷凍蝕刻附件，如日立公司生產(chǎn)的HFZ1型，它與FE1型加溫蝕刻裝置一起安裝在HUS5型真空噴鍍儀中使用。以上兩種類(lèi)型各有優(yōu)缺點(diǎn)，專(zhuān)用裝置優(yōu)點(diǎn)在于操作方便，能連續制樣，效率高。缺點(diǎn)是價(jià)格貴；附件裝置價(jià)格雖便宜，但不能連續操作，效率低�！ ±鋬鑫g刻的操作方法按以下步驟進(jìn)行�！ � 1.預處理取新鮮組織塊，大小為15～3～5mm，用25％戊二醛固定1～3小時(shí)。為防止冰晶形成，用30％甘油生理鹽水浸泡8～12小時(shí)。 2.冷凍斷裂是在冷凍條件下使樣品變得又硬又脆，用刀劈裂樣品，暴露觀(guān)察面。因為是用刀劈裂的樣品，斷裂往往發(fā)生在細胞被凍結后較脆弱的部位，多數是沿細胞及細胞器的膜裂開(kāi)。由于斷裂面是凸凹不平的，所以圖像立體感強。冷凍斷裂時(shí)，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必鋒利，但不能有缺口、油污和水份，還需保持清潔干燥。冷凍復型的斷裂操作要在真空中進(jìn)行，是因為真空對熱傳導性差，能使樣品較長(cháng)時(shí)間維持在較恒定溫度下進(jìn)行斷裂操作，同時(shí)也便于進(jìn)行下步的蝕刻處理。儀器中進(jìn)行斷裂的最佳條件：真空度為133×10-5～3×40-3Pa(1×10-5～3×10-5Torr)，樣品升溫至-100℃～-110℃�！ � 3.蝕刻就是在真空中使冷凍樣品表面上的冰升華。目的是為了暴露出樣品斷裂面上的超微結構，便于噴鍍。一般認為最佳蝕刻深度約為30nm。若蝕刻深度不夠，結構被冰掩蓋不能充分暴露出來(lái)，圖像模糊；若蝕刻深度過(guò)大，超微結構因其基礎支持不足而倒塌，從而破壞了超微結構。蝕刻深度是由蝕刻速度和蝕刻時(shí)間決定的，而蝕刻速度是受真空度、溫度、水蒸汽壓所影響。一般蝕刻條件：真空度為133×10-3～133×10-4Pa(10-5～10-6 Torr），溫度降至-100℃，在此條件下，蝕刻速度大約為2nm/s。 4.噴鍍即在樣品斷裂面上噴鍍一層鉑膜及碳膜。鉑膜厚度為2～5nm。為使圖像具有立體感，噴鉑的方向與樣品成45度角。為加固鉑膜強度，再?lài)婂円粚犹�，噴碳的方向與樣品面成90度角。 5.剝離清洗噴鍍后，將樣品取出放入10～30％次氯酸鈉腐蝕液中，樣品漸冒氣泡并與復型膜分離。隨后用蒸餾水仔細清洗復型膜。 6.撈膜將清洗后的復型膜撈在不加支持膜的400目載網(wǎng)上，待干后電鏡觀(guān)察。 圖12-14 馬傳染性貧血病毒感染驢白細胞的冷凍蝕刻圖像。箭頭所指為病毒粒子，比例尺為100nm
上一篇：掃描電鏡樣品的制備
下一篇：冷凍超薄切片-電鏡樣品的特殊制備技術(shù)
海博微信公眾號
海博天貓旗艦店
