超薄切片法是研究病毒特征以及病毒與細胞之間相互作用的有效手段。圖12-5是生長(cháng)在雞胚羊膜細胞上的馬甲2型流感病毒�？蓮膱D中清楚看到馬甲2型流感病毒粒子的形態(tài)。病毒粒子沿細胞表面整齊排列，其遠離細胞表面的一端比近端電子密度大。并可看到病毒粒子從細胞膜上芽生。 圖12-5 生長(cháng)在雞胚羊膜細胞上的馬甲2型流感病毒 ——自賈補年等切片厚度很薄，需在01μm以下，用環(huán)氧樹(shù)脂作包埋劑，一般可以制成5～70nm厚度的切片。超薄切片的制備包括固定、脫水、包埋、切片和染色�！� 1.固定 固定的目的，是終止細胞的生化過(guò)程，保持細胞原來(lái)的微細構造，避免細胞自溶和造成人為假像。我們要研究的材料是各種各樣的，材料本身的構造不同，各有特點(diǎn)，其固定條件也要隨研究材料的不同而選擇，不能千篇一律。一般說(shuō)來(lái)，要求固定液能在固定期間維持一定的pH值；具有適當的滲透壓，防止固定期間細胞或細胞器腫脹或收縮；具有適當的離子濃度，防止固定期間某些物質(zhì)的沉淀或抽出。固定液本身應無(wú)毒性或毒性較小。為此，固定液要用緩沖液配制�！ �(1)固定劑和緩沖液的性質(zhì)：超薄切片用固定劑有戊二醛、四氧化鋨、多聚甲醛、高錳酸鉀等，常用的是前兩種�！ ∩唐肺於跜HO(CH2)3CHO)］是25％或239％的淡黃色水溶液，也有的是50％的水溶液。戊二醛應在4℃或-20℃低溫避光貯存，長(cháng)期室溫貯存易形成聚合體。與細胞起反應的主要是戊二醛單體，單體的最大吸光度在280nm，聚合體的最大吸光度在350nm，故可用分光光度計測定戊二醛的純度。Kurstak指出，OD２35/OD280比值大于3即顯著(zhù)降低其交聯(lián)作用。不純的戊二醛可用活性炭濾過(guò)或蒸餾純化�；钚蕴考兓ㄊ窃谑惺�25％的戊二醛中加入10％(W/V)的活性炭，4℃搖動(dòng)1小時(shí)，然后濾過(guò)，可重復數次，直到吸收光譜達到標準為止�！ ∥於┑闹饕攸c(diǎn)是：兩個(gè)醛基可與細胞成分發(fā)生交聯(lián)，對糖原和核蛋白，尤其是對微管和內質(zhì)網(wǎng)等膜系統以及細胞基質(zhì)有較好的固定作用；對組織的穿透力強，可固定數毫米的組織塊；可保存某些酶的活性，對脂質(zhì)不起固定作用。用戊二醛固定的組織，于4℃保存數周至數月不產(chǎn)生明顯變化�！ ∩唐匪难趸~(OsO4)呈淡黃色或無(wú)色結晶。溶點(diǎn)395～410℃，沸點(diǎn)130℃，溶于水、酒精、醚和氯仿等，在水內的溶解度是61g/100ml(18℃)，其水溶液不呈酸性。通常以玻璃安瓿包裝，每個(gè)安瓿為05g或1g�！ ∷难趸~的主要特點(diǎn)是能固定蛋白質(zhì)。所以，雖然對核酸和碳水化合物的保存較差，但機體內核酸和碳水化合物都與蛋白質(zhì)呈復合的形式，因而，四氧化鋨幾乎能和所有的細胞成分結合。四氧化鋨與脂肪的不飽和脂肪酸鏈結合，形成脂肪鋨復合物，對脂肪呈現良好的保存作用；但不能保存糖原，對微管的固定作用較差。四氧化鋨分子大，擴散慢，對組織的穿透力較差，被固定的組織塊不能大于1mm3。四氧化鋨分子的密度大，具有電子染色作用�！ 《嗑奂兹┦菃喂δ茉噭�，不起交聯(lián)作用。它的最大特點(diǎn)是穿透力強，因而可較好地固定大塊組織。多聚甲醛可保存蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和一些糖原，但不能保存多糖。多聚甲醛固定的組織呈可逆反應，因此漂洗時(shí)要注意�！ ‰娮语@微鏡技術(shù)常用的緩沖液有磷酸緩沖液、二甲胂酸緩沖液和巴比妥醋酸緩沖液�！ ×姿峋彌_液的配方甚多，效果相差不明顯。這種緩沖液比其它幾種緩沖液更符合“生理”條件，對細胞和操作者無(wú)毒性，因而使用很廣。其缺點(diǎn)是在固定期間可能出現沉淀，污染樣品�！ 《纂纤峋彌_液的優(yōu)點(diǎn)是容易配制，溶液本身不利于微生物的生長(cháng)，長(cháng)期貯存穩定，加入低濃度(1～3mmol/L)的鈣不發(fā)生沉淀。主要缺點(diǎn)是含胂，而胂是有毒物質(zhì)�！ “捅韧转泊姿峋彌_液與上兩種緩沖液比較起來(lái)，優(yōu)點(diǎn)是不形成沉淀，缺點(diǎn)是緩沖力小。由于巴比妥鈉能與醛起反應而失去緩沖力，所以這種緩沖液不能配制戊二醛固定液�！ �(2)固定時(shí)間和溫度的選擇：要根據樣品的性質(zhì)、大小和固定液的成分決定固定的時(shí)間和溫度。要選擇適當的溫度和時(shí)間，使得固定液和樣品剛好起反應。時(shí)間過(guò)長(cháng)，固定液將抽出樣品中的某些成分，增加人工損傷，如戊二醛長(cháng)時(shí)間固定會(huì )形成一種髓鞘樣圖形，四氧化鋨長(cháng)時(shí)間固定會(huì )抽出細胞質(zhì)基質(zhì)的許多蛋白質(zhì)；固定時(shí)間過(guò)短，則固定不完全�！ ∫话銇�(lái)說(shuō)，較致密的樣品，固定時(shí)間要長(cháng)些，疏松樣品固定時(shí)間較短。樣品塊大，固定時(shí)間要長(cháng)。有些樣品在室溫下固定效果好，有些樣品則需要較低的溫度，即0～4℃固定效果較好。溫度低，樣品的酶活性低，可減慢自溶，但固定液的滲透亦慢，為此，將延長(cháng)固定時(shí)間。溫度高，樣品的酶活性高，自溶速度快，但固定液的滲透亦快，固定速度就快。在0～25℃間，看不出有顯著(zhù)差別，但最常用4℃固定�！ �(3)固定方法：電鏡工作者現已公認戊二醛和四氧化鋨雙固定的標準固定方法，即所謂的通用固定法，包括初固定、漂洗和二次固定等步驟�！ 〕豕潭�(或前固定)：用25％戊二醛(01mol/L磷酸緩沖液，pH74，含有25mmol/L的氯化鈣)或2％的多聚甲醛加25％戊二醛4℃固定1小時(shí)�！ ∑矗河昧姿峋彌_液(01mol/L，pH74，含25mmol/L氯化鈣)4℃洗1小時(shí)(其間更換3次以上漂洗液)�！ 《喂潭�(或后固定)：1％四氧化鋨(01mol/L磷酸緩沖液，pH74，含25mmol/L氯化鈣)室溫或4℃固定1小時(shí)�！ ∠扔梦於┰儆盟难趸~的雙固定法有許多優(yōu)點(diǎn)，一是戊二醛和四氧化鋨能保存的樣品成分不盡相同，雙固定法可以取長(cháng)補短；二是樣品在戊二醛固定液內或經(jīng)戊二醛固定后，可貯存較長(cháng)的時(shí)間；三是戊二醛滲透速度快，可固定較大的組織塊，先用戊二醛固定樣品，便于切成適合于四氧化鋨固定的小塊�！ ∥於┦沁�原劑，四氧化鋨是氧化劑，所以用戊二醛作為初固定后必須徹底洗去未反應的戊二醛，才能用四氧化鋨進(jìn)行二次固定�！ ≡诠潭ㄇ盎蚬潭ㄖ幸獙悠愤M(jìn)行適當的修整，否則將形成嚴重的人工損傷。一般要求： 快：力爭在半分鐘內將樣品浸入固定液�！ ⌒。撼Ｓ霉潭ㄒ捍┩噶^弱，樣品塊應小于1mm３�！ 剩弘婄R的放大倍數大，因而觀(guān)察的樣品面積很小，所以，選擇部位要準�！ ±阂梅浅ｄh利的器械，通常用刮臉刀片切割，避免因牽拉和擠壓造成人工損傷�！ 悠凡煌�，固定過(guò)程亦不完全相同。在病毒學(xué)研究工作中，最常見(jiàn)者是組織培養的單層細胞和動(dòng)物組織�！ 、賳螌蛹毎墓潭ǎ骸 螌蛹毎嘤贸恋韷K法固定，即用橡皮刀或刮子刮下貼壁細胞，把細胞懸液倒入10ml尖底離心管內，1000～2000r/min離心10分鐘�！ 〕豕潭ǎ旱沟艄軆壬锨逡�，沿管壁慢慢加入0～4℃的2％戊二醛固定液，注意加時(shí)不要沖散沉淀塊。加入的固定液量要為沉淀塊體積的10倍以上。4℃下放15～30分鐘�！ ∑矗喝〕龀恋韷K，放在蠟盤(pán)上，加數滴4℃緩沖液(如用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，則要配成005～01mol/L濃度，每100ml緩沖液加入73g蔗糖，調整緩沖液的滲透壓)，用刮臉刀片把沉淀塊切成約1mm3大的立方塊，用鑷子或吸管放入帶蓋小玻瓶?jì)龋?℃用緩沖液漂洗3次以上，每次數分鐘，充分洗去未結合的戊二醛�！ 《喂潭ǎ旱沟羝匆�，加入4℃的1％四氧化鋨固定液，加入量約為樣品塊體積的10倍，4℃下放1～2小時(shí)�！ ≡谀承┭芯抗ぷ髦�，要求將細胞原位固定后再刮下離心，或者用多聚甲醛、四氧化鋨、高錳酸鉀作為初固定。在這些情況下，沉淀塊疏松，當進(jìn)行下面各過(guò)程時(shí)容易丟失樣品，為此，可把樣品懸浮在液態(tài)瓊脂中，凝固后切成小立方塊再進(jìn)行漂洗和二次固定等過(guò)程，具體方法如下： a.用緩沖液配制成2％的瓊脂溶液，加熱融化備用�！ .把盛瓊脂緩沖液和沉淀塊的離心管都放在45～50℃水浴中加溫�！ .用一溫熱吸管吸一滴瓊脂(約003ml)溶液加入沉淀塊試管內，搖動(dòng)，使細胞均勻懸浮在瓊脂中，浸10分鐘以上�！ .用溫熱吸管把懸液吸出滴在冷載玻片上形成1小滴�！ .凝固后把含細胞的瓊脂凝塊切成約1mm3的小塊進(jìn)行漂洗、二次固定等�！ ∫⒁獗M可能少加瓊脂，否則，切片上的細胞數量將很少�！ ∫部扇慷紤腋」潭�，即初次固定、漂洗、二次固定都用離心方法進(jìn)行。二次固定后，再按上述方法包在瓊脂中，而后進(jìn)行脫水等�！ 、趧�(dòng)物組織的固定：根據不同的研究目的用不同的方法。一般是直接從活體或殺死的動(dòng)物體切取適當的組織放入固定液浸泡固定。有時(shí)需將動(dòng)物麻醉，解剖出要研究的器官或組織，將固定液直接滴在這些被研究的器官或組織上，也可直接注入器官或組織內部，這樣可保證血液供給，避免因缺血造成的損傷。經(jīng)這樣固定后，切取適當的組織在室溫或4℃繼續浸泡固定1小時(shí)。固定液用5％戊二醛為宜。以下過(guò)程與單層細胞沉淀塊法相同。有些研究者用灌注法固定，這種方法是用固定液逐步取代動(dòng)物體內的血液來(lái)達到固定目的。其優(yōu)點(diǎn)是固定效果好，缺點(diǎn)是需用固定液的量大，方法復雜，所以，除特殊需要外，不經(jīng)常使用�！ � 2.脫水 目前使用的大多數包埋材料不溶于水，因而需要把固定后的樣品脫水，才可使包埋材料浸入樣品內部，達到包埋目的。使用最廣的脫水劑是丙酮和乙醇。脫水劑需從低濃度到高濃度逐步過(guò)渡，否則將因組織急驟收縮而出現人工損傷�！ 〕Ｒ幟撍椒ǎ捍朔ㄓ糜趩螌蛹毎囵B物�！ � 50％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鐘 70％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鐘 95％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分鐘 100％丙酮(或乙醇)，4℃，10～15分鐘 100％丙酮(或乙醇)，室溫，10～15分鐘 100％丙酮(或乙醇)，室溫，10～15分鐘 100％丙酮或乙醇要用干燥劑吸水，一般使用烤干的硫酸鈉或硫酸銅�！ 】焖俨糠置撍椒�(Robbins等，1967)： 20％乙醇80％水，室溫，30秒 60％乙醇40％Epon812，室溫，5分鐘 30％乙醇70％Epon812，室溫，5分鐘 100％Epon812，室溫，5分鐘 隨后即可用Epon812浸透和包埋�！ …h(huán)氧丙烷可快速與環(huán)氧樹(shù)脂混合，并且即使在包埋劑中殘留少許，聚合后也不會(huì )出現不良后果。所以，一些不易浸透的樣品在脫水后經(jīng)過(guò)兩次環(huán)氧丙烷處理，每次15分鐘，隨后再浸透和包埋，這樣可減少浸透不完全的缺陷。脫水后的樣品要嚴防濕氣。因此，使用的器皿應是烤干的，室內相對濕度以50％左右為宜�！ � 3.包埋 包埋的目的是用包埋劑支持整個(gè)樣品結構，并形成特定的機械性能,以便于切片�！ �(1)包埋劑的性質(zhì)及種類(lèi)： �、倮硐氚駝⿷邆涞奶匦裕�?jiǎn)误w時(shí)粘度低；聚合均一，體積變化��；容易切片；在電子束轟擊下穩定；電子透明度好，不形成背景反差；易溶于脫水劑；不同批號的產(chǎn)品，性能一致；價(jià)格低廉，容易獲得�！ 、诎駝┓N類(lèi)： a.環(huán)氧樹(shù)脂類(lèi) Epon812和Quetol812以及國產(chǎn)環(huán)氧樹(shù)脂618是常用的包埋劑，尤其是Epon812更為常用，它是由甘油和表氯乙醇反應而來(lái)的7個(gè)單體組成，對電子束穩定，但由于含有較高的疏水成分，故粘性較大，且因含二環(huán)氧化物而有致癌性。618為二酚基丙烷型環(huán)氧樹(shù)脂，是目前使用較多的國產(chǎn)環(huán)氧樹(shù)脂，它對組織損傷小，保存結構精細，特別是對膜性結構保存更好，但粘度大，浸透不均勻，操作不太方便，若與國產(chǎn)600型環(huán)氧樹(shù)脂混合使用，可降低其粘度。Araldites屬芳香族類(lèi)，對熱及電子束有很好的穩定性，交聯(lián)程度低，粘度小是其優(yōu)點(diǎn)；Spurr(ERL4206)是一種乙烯環(huán)已烷二氧化物，由長(cháng)鏈脂族酐交聯(lián)，它在環(huán)氧樹(shù)脂類(lèi)里是粘度最低的，但缺點(diǎn)是毒性大并具有致癌性。Durcupon為脂族多聚環(huán)氧化物，粘度低，因它與非水溶性的其它環(huán)氧樹(shù)脂和水溶性的異丁酸類(lèi)樹(shù)脂都具有親和性，常用來(lái)做浸透劑，以代替環(huán)氧丙烷�！ .丙烯類(lèi)樹(shù)脂 Lowicryl是一類(lèi)重要的丙烯樹(shù)脂，為極性丙烯酸和異丁酸酯，由脂族乙二醇二異丁烯酸交聯(lián)，與Epon一樣對電子束穩定，在低溫下具有粘度低，脫水快和浸透好的特點(diǎn)，聚合時(shí)用苯偶姻甲酯作始動(dòng)劑，在波長(cháng)360nm紫外線(xiàn)間接照射下低溫(-30℃～-50℃)聚合過(guò)夜。Lowicryls包括親水性的K4M、K11M及疏水性的HM20、HM23。前二者的脫水劑可用甲醇、乙醇、丙酮、甘油等，因其在組織含有5％水分時(shí)也可聚合，所以浸透可在部分水化狀態(tài)下進(jìn)行，后二者的脫水劑不能用甘油和乙二醇，它可在-70℃下使用，許多生物物質(zhì)可保持穩定，甚至可保存結合水。LRWhite與LRGold是親水性丙烯酸單體混合物，交聯(lián)穩定，粘度低，可迅速浸透組織，對電子束穩定，組織經(jīng)70％酒精脫水即可進(jìn)入LRWhite中浸透，聚合可在50℃或室溫下進(jìn)行，如果使用加速劑則可在10～20分鐘內聚合。丙酮在該樹(shù)脂內可作為一種自由基清除劑，只要有一點(diǎn)丙酮殘留都會(huì )影響聚合，因此一般不用丙酮作脫水劑。在聚合時(shí)要注意盡量減少氧氣的存在，用帶蓋膠囊聚合。GMA是由乙二醇甲基丙烯酸酯組成，含有3％水分，多用于細胞化學(xué)研究，不需去除樹(shù)脂就可用很多特殊染料染色，組織先在含有70％蔗糖緩沖液中放置，然后用含水量漸少的GMA及純GMA浸透包埋，于紫外線(xiàn)照射下4℃聚合�！ �(2)包埋劑的配制： 目前最常用的是環(huán)氧樹(shù)脂類(lèi)。環(huán)氧樹(shù)脂是一種熱塑性樹(shù)脂，呈蜜黃色半液體狀，有環(huán)氧基和羥基兩種化學(xué)反應基團，當與一定的酸酐(如順丁烯二酸酐、十二烷基琥珀酸酐和甲基內次甲基四氫苯二甲酸酐等)混合后，在一定溫度下交聯(lián)成穩定的網(wǎng)狀大分子結構，其機械性能取決于單體和硬化劑(即酸酐)的比例，因此，選擇適當的配比，才能保證切片質(zhì)量，例如，當用Epon812時(shí)，一般選酸酐與樹(shù)脂的比為07�！ 、�618包埋劑配方Ⅰ [FL(] 環(huán)氧樹(shù)脂618 順丁烯二酸酐 苯二甲酸二丁酯(簡(jiǎn)稱(chēng)DBP) 二乙基苯胺5ml2g15～2ml04ml 將環(huán)氧樹(shù)脂618倒入燒杯內，加熱至80℃，用注射器或量筒量取所需量的環(huán)氧樹(shù)脂618置廣口玻瓶?jì)�，加入順丁烯二酸酐，放�?0℃溫箱中約5～10分鐘，使其溶解(因順丁烯二酸酐的溶點(diǎn)為56℃左右，需加溫溶解)，用磁攪拌器或玻棒攪拌5～10分鐘，攪拌均勻后冷至室溫，用注射器加入DBP，攪拌均勻后備用。用前半小時(shí)左右，用帶針頭的小注射器在攪拌情況下，逐滴加入二乙基苯胺，加完后繼續攪拌5～10分鐘即可使用�！ 、�618包埋劑配方Ⅱ 環(huán)氧樹(shù)脂618 十二烷基琥珀酸酐(DDSA) 6ml4ml 2,4,6三(二甲氨基甲基苯酚)(DMP30)01ml 用注射器或量筒量取618和DDSA，充分攪拌均勻后逐滴加入DMP30，邊攪邊滴，加完后繼續攪拌5～10分鐘。溶液比較粘稠，可放37℃溫箱使其變稀，氣泡逸出。用前半小時(shí)配制�！ 、�618包埋劑配方Ⅲ 考慮到618配方Ⅱ比較粘稠，聚合塊較脆，加入DBP增塑劑后，易于切片�！ � 環(huán)氧樹(shù)脂618 DDSA DBP DMP30 6ml 4ml 03～08ml 03～02ml ④Epon812包埋劑配方 A液： Epon812 DDSA B液：Epon812 62ml 10ml 10ml 甲基內次甲基四氫苯二甲酸酐(MNA) 89ml DMP30占總重量的15％ 先配制成A液和B液備用。使用前將A液與B液按一定比例混合后攪拌均勻，然后邊攪拌邊滴加DMP30，攪拌均勻。A液和B液的比例隨氣候而改變，通常冬天使用A∶B＝2∶8，夏天使用1∶9或純B液。A液多，聚合塊軟；B液多，聚合塊硬。通常根據環(huán)氧值計算的重量百分比，按表12-2的配方進(jìn)行配制�！ � 表12-2 環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑的配制 包埋劑數量(g) MNA(g) DDSA(g) E(g) DMP30(g) 10 30 15 55 015 20 60 30 110 030 30 91 45 164 045 40 121 60 219 060 50 151 75 274 075 (3)浸透： 浸透是用包埋劑置換樣品內的脫水劑或中間溶劑。這一步一定要徹底，否則得不到好的切片。如果用環(huán)氧丙烷作脫水劑與包埋劑的中間溶劑，雖殘留少量環(huán)氧丙烷并不影響切片質(zhì)量�！ ∫话闱闆r下，可先用脫水劑和包埋劑1∶1混合液過(guò)渡，然后再用純包埋劑置換。如果樣品較致密，可用脫水劑和包埋劑2∶1、1∶1、1∶2混合液、純包埋劑逐步置換，也可用環(huán)氧丙烷作為中間溶劑置換脫水劑，再用環(huán)氧丙烷與包埋劑1∶1混合液和純包埋劑置換。把樣品放在慢速振蕩器上浸透，可收到很好效果。此外，減壓也可促進(jìn)浸透�！ �(4)聚合：聚合就是將已浸透的樣品固化。有兩種聚合方法，一是加溫，二是紫外線(xiàn)照射。加溫是常用方法，大多數環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑于60℃12小時(shí)即可固化，50℃約需2天，70℃約需8小時(shí)。一般用35℃、45℃、60℃各12小時(shí)聚合，或60℃24～48小時(shí)聚合。某些組織化學(xué)樣品，加溫將破壞其中一些成分，如酶活性等，則可用紫外線(xiàn)照射聚合，50℃需48小時(shí)，40℃需70小時(shí)�！ �(5)水溶性包埋劑包埋方法：樣品經(jīng)固定水洗后不必經(jīng)過(guò)脫水，可直接進(jìn)入各級Durcupan中，最后入Araldite包埋。
其具體步驟如下： 50％ Durcupan水溶液 20分鐘
↓ 70％ Durcupan水溶液 20分鐘
↓ 90％ Durcupan水溶液 20分鐘 ↓ 100％ Durcupan溶液 40分鐘 ↓ 100％ Durcupan溶液 40分鐘 ↓ Durcupan∶Araldite(3∶1) 60分鐘 ↓ Durcupan∶Araldite(1∶1) 60分鐘 ↓ Durcupan∶Araldite(1∶3) 8～12小時(shí) ↓ Araldite(純) 60分鐘 (6)LowicrylK4M低溫包埋劑包埋方法∶LowicrylK4M低溫包埋主要用于免疫標記電鏡樣品制備。將固定的細胞塊(樣品)，用01mol/L二甲胂酸緩沖液洗3次，每次10分鐘；再往50％、60％、70％、80％、90％、95％酒精脫水各5分鐘，100％酒精脫水3次，每次30分鐘；100％酒精∶樹(shù)脂(LowicrylK4M)＝2∶1、1∶1、1∶2，各1小時(shí)，純樹(shù)脂浸透過(guò)夜。最后包埋在特制的模具中，置于紫外線(xiàn)下-25℃，前1小時(shí)將溫度降至-25℃，然后開(kāi)紫外線(xiàn)聚合24小時(shí)，室溫放置2天，常規切片�！ 「剑篖owicrylK4M配方 CrosslinkerA MonomerB MitiatorC2701730010 配制時(shí)按順序分別加入即可�！� 4.切片及其準備工作 (1)載網(wǎng)：載網(wǎng)由金屬制成，網(wǎng)孔的形狀、大小和數量可根據實(shí)驗要求選擇。常用的載網(wǎng)由銅制成，稱(chēng)銅網(wǎng)。直徑為2mm或3mm，每英寸200～300目，網(wǎng)孔呈圓形或方形。銅網(wǎng)要徹底清洗干凈，有條件時(shí)可用超聲波清洗，亦可用濃硫酸浸泡15分鐘左右，其間不斷攪動(dòng)，而后用餾水反復沖洗，洗好后放在濾紙上吸干備用�！ �(2)制膜：常用聚乙烯醇縮甲醛(formvar)膜。取025～03g聚乙烯醇縮甲醛，用三氯甲烷制成025～03％的溶液密閉備用。制膜時(shí)，手持表面無(wú)劃痕的潔凈玻片浸入上述溶液中，隨即慢慢提出，在液面上停留1～2分鐘，使溶劑揮發(fā)。室溫自然干燥后用刀片在玻片四周劃切，然后將玻片與水面呈45度角緩緩壓入水中，借助燈光可見(jiàn)隨著(zhù)玻片的壓入一層薄膜漂浮在水面上。將潔凈銅網(wǎng)一個(gè)個(gè)擺在薄膜上，把比膜稍大的濾紙條蓋在載網(wǎng)上，用手指壓入水面后在水內翻轉180度托出水面，烤干備用。如果需要，可在制好的膜上噴一層碳膜，加強膜的機械強度。加碳膜是在真空噴鍍儀內進(jìn)行的，噴碳時(shí)在膜附近放一小塊白色瓷片，瓷片上預先滴一小滴擴散泵油，根據瓷片上的顏色大略判斷碳膜的厚度，一般瓷片呈淡茶色即可，膜厚約10nm�！ �(3)修塊：修塊的目的是去除組織周?chē)陌窠橘|(zhì)和無(wú)關(guān)部分，使組織塊成為一定的形狀和大小，便于切片。修塊可在專(zhuān)門(mén)的修塊機或切片機上進(jìn)行，亦可在解剖顯微鏡下用刮臉刀片手工修整�？砂呀M織塊的表面修成梯形、正方形或長(cháng)方形等，但不管修成哪種形狀，其頂邊和底邊必須平行，否則不能形成連續切片帶。組織塊表面積小些容易切片，一般邊長(cháng)01mm左右即可�！ �(4)制刀：切片一般用玻璃刀，也可用鉆石刀。鉆石刀可以切較硬的樣品，但其價(jià)格昂貴，國內尚未大量生產(chǎn)，故未得到普遍應用。玻璃刀由5～7mm厚的硬質(zhì)玻璃制成，制刀前要把玻璃清洗干凈，用專(zhuān)門(mén)的制刀機制刀，成功率高，刀的質(zhì)量好。無(wú)制刀機可手工劃割�！ ∫诘渡涎b一水槽，以便收集切片，水槽可用塑料膠布或氧化鋅橡皮膏圍成，刀與膠布接觸處要燙上一層蠟，以防漏水。也可使用塑料或金屬制的商品水槽。切片前應對刀的質(zhì)量進(jìn)行檢查，方法是將刀裝在切片機的刀座上，打開(kāi)聚光燈，移動(dòng)燈和刀刃的相對位置，用高倍鏡觀(guān)察，刀刃的最佳部分是一條平直亮線(xiàn)，呈鋸齒狀的部位不易切出好片，一般最佳刀刃部分約占整個(gè)刀刃長(cháng)度的1/5～1/4。水槽內的液體一般用蒸餾水，水面應和刀刃在同一平面上，用熒光燈在適當位置上照射，液面和刀刃的可用部分應呈白色，切片時(shí)隨時(shí)觀(guān)察切片情況。切片厚度不同，在燈光照射下可看到不同顏色的干涉色，因而可大體判斷切片的厚度，一般認為： 暗灰色 40nm以下 灰 色 40～50nm 銀白色 50～70nm 金黃色 70～90nm 用樹(shù)脂包埋的組織塊，一般切成50～60nm的切片為好�！ �(5)切片：把已修好的組織塊夾入樣品夾內，裝在樣品臂上，把刀裝在刀座上，在顯微鏡下將刀的高度調節到與刀座上的參考規相等，旋轉組織塊使塊面的兩個(gè)平行邊與刀刃平行，讓長(cháng)邊在下方，塊面中心線(xiàn)與刀刃處于同一水平線(xiàn)上，移動(dòng)刀使可用部分對準塊面，調好切片速度和間隙角后慢慢手動(dòng)粗調旋轉鈕切下第一個(gè)切片后即可連續切片。切片速度、間隙角和刀尖角可根據不同的樣品試驗決定，一般切硬材料用較小的間隙角、較大的刀尖角和較慢的切速。較軟的材料宜用大些的間隙角、較小的刀尖角和較快的切速。通常，間隙角用3～5度，切速用2～10mm/秒，刀尖角用45度�！ ∏械揭欢〝盗康那衅笸Ｖ骨衅�，打開(kāi)切片機內部的冷卻風(fēng)扇，用睫毛制成的“拔針”把切片歸攏集中，用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣直接在水面上貼取切片，用細濾紙條從網(wǎng)邊吸去液體，自然干燥。切片機在用風(fēng)扇冷卻10分鐘后，即可關(guān)掉風(fēng)扇進(jìn)行再切�！ � 5染色 目前，最常用的超薄切片染色法是醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色法�！ �(1)染液的配制： 醋酸鈾飽和乙醇溶液 醋酸鈾 50％乙醇5g50ml 把醋酸鈾和乙醇放入50ml棕色滴瓶?jì)�，搖動(dòng)10分鐘，使醋酸鈾充分溶解，最后仍會(huì )有一些醋酸鈾不溶解，說(shuō)明已成飽和溶液，靜置1～2天后取上清液使用�！ 幟仕徙U染液 硝酸鉛［Pb(NO3)］ 檸檬酸鈉［Na3(C6H5O7)•2H2O］ 或Na3(C6H5O7)•5H2O 蒸餾水133g176g208g30ml 將上述藥品和餾水放入50ml容量瓶?jì)�，用力搖動(dòng)1分鐘后，間隔搖動(dòng)數次，30分鐘后可見(jiàn)溶液呈乳白色，加入1mol/L氫氧化鈉8ml，溶液變?yōu)闊o(wú)色透明后加餾水至50ml，搖勻，pH約為12，置冰箱密閉保存�！ �(2)染色方法：染色是在蠟盤(pán)上進(jìn)行的，應制作兩套帶蓋蠟盤(pán)，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別使用。用直徑約為15cm的玻璃平皿，在皿蓋內鋪加一層熔化的石蠟，冷卻后形成光滑的平面，作為染色蠟盤(pán)。染色時(shí)將飽和醋酸鈾滴在蠟盤(pán)上，有幾個(gè)載網(wǎng)就滴幾滴染液，把載網(wǎng)有切片的一面向下漂浮在染液滴上，再將皿底倒扣在蠟盤(pán)上，室溫染15～30分鐘。用鑷子夾住載網(wǎng)邊在盛餾水的小杯中洗去多余的鈾染液，用濾紙條吸干�！ �1N氫氧化鈉01ml用餾水稀釋成10ml，取2～4ml與檸檬酸鉛染液等量混合后滴在蠟盤(pán)上(如果檸檬酸鉛染液保存時(shí)間過(guò)長(cháng)，可1000r/min離心5分鐘取上清液使用)，將已染醋酸鈾的載網(wǎng)切片面向下漂浮在染液滴上，加蓋，室溫染色5～15分鐘。為防止空氣中的二氧化碳與鉛反應生成碳酸鉛沉淀污染切片，可用1小玻皿盛適量氫氧化鈉放在蠟盤(pán)上，吸去空氣中的二氧化碳。染完后，相繼在盛餾水、002N氫氧化鈉溶液、餾水的三個(gè)玻瓶?jì)认慈ポd網(wǎng)上的剩余染液，用濾紙吸干�！ 榱丝朔∏衅碾聊啃院碗婄R視野的局限性，可在超薄切片前先用超薄切片機切一張05～2μm厚的半薄切片，染色后用光學(xué)顯微鏡選擇做超薄切片的適當部位。同時(shí)，這也是研究細胞之間關(guān)系的手段之一�！ ≈谱靼氡∏衅瑫r(shí)，先行削去包埋塊組織周?chē)陌駝�，使塊表面成一直角梯形，在超薄切片機上手動(dòng)粗進(jìn)刀旋鈕切取05～2μm厚的切片，用鑷子將切片轉移到干凈載玻片上(玻片上可預先涂一薄層蛋白甘油，使切片不易脫落)。用下述任何一種方法染色后光學(xué)顯微鏡檢查�！ 、偬烨嗒裁捞m染色 染色時(shí)將1％天青Ⅱ水溶液、1％美藍溶液(用1％硼砂水溶液配制)等量混合，滴在切片上，電熱板上加溫3～5分鐘，用水沖去染液�！ 、诩装匪{染色 染色時(shí)將1ml1%苯甲胺藍溶液和20ml25%碳酸鈉溶液混合，滴在切片上，45～50℃染色10～20分鐘，用水沖去染液�！ 、奂匪_染色 染色時(shí)將姬姆薩原液1∶9稀釋?zhuān)我坏蜗♂屢河谇衅�，在酒精燈上加溫染色數秒�?勿煮沸)后，用濾紙吸去染液。
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