雞胚(包括其它禽胚)是正在 發(fā) 育中的機體,多種動(dòng)物病毒能在雞胚中增殖和傳代,并可用雞胚制備某些病毒抗原、疫苗和卵 黃抗體等。禽胚的優(yōu)點(diǎn)在于胚胎的組織分化程度低,又可選擇不同的日齡和接種途徑,病毒易 于增殖,感染病毒的組織和液體中含有大量病毒,容易采集和處理,而且來(lái)源充足,設備和操作 簡(jiǎn)便易行。應用雞胚需要注意的首要問(wèn)題是胚內可能污染細菌(如沙門(mén)氏菌等),尤其是經(jīng)母 雞垂直傳遞的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽腦脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。另外,胚胎 中往往含有因母雞免疫而產(chǎn)生的卵黃抗體,影響同種病毒的增殖。因此理應選用SPF雞群產(chǎn)的 蛋。雖然喂飼添加抗生素飼料母雞的蛋中含有抗生素,但對病毒學(xué)實(shí)驗通常無(wú)影響。病毒在 雞胚中增殖,除部分病毒產(chǎn)生痘斑、引起充血、出血、壞死灶和死亡等變化外,許多病毒缺 乏特異性的感染指征,必須應用血清學(xué)反應或檢查病毒抗原以確定病毒的存在。雞胚實(shí)驗 必需的器械主要有孵卵箱、檢卵燈、卵盤(pán)、開(kāi)卵鉆、卵杯和羊膜腔接種用的照明燈等。操作 時(shí)要注意防止污染,選擇適宜的接種途徑和培養溫度,并要認真觀(guān)察,及時(shí)收獲。雞蛋孵育 前不要洗擦,因洗擦能除掉卵殼表面的膠質(zhì)保護層,容易致發(fā)細菌感染。沒(méi)有孵卵箱時(shí),也可 用普通恒溫箱代替,為保持40%～70%的相對濕度,于其下部應放一盛水盤(pán)。最適溫度為38～39 ℃,并應每天翻卵1～2次。現扼要介紹常用的絨毛尿囊膜、尿囊腔、卵黃囊和羊膜腔等四 種接種方法(圖11-1)。〖JZ〗圖11-1 雞胚接種的途徑
1.絨毛尿 囊膜接種〖HT5SS〗主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖,這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上形 成痘斑或病斑。用10～12日齡雞胚,在胚胎附近略近氣室處,選擇血管較少的部位,用電烙器 在卵殼上烙出一個(gè)直徑約3～4mm的烤焦圈,用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵殼,造成 卵窗,但不可損傷殼膜。在氣室端中央也鉆一個(gè)小孔。隨后用針尖輕輕挑破卵窗中心的殼膜, 切勿損傷其下的絨毛尿囊膜。滴加1滴滅菌生理鹽水于剌破處。用橡皮乳頭緊貼于氣室中央 小孔上吸氣,造成氣室內負壓,使卵窗部位的絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室,此時(shí)可見(jiàn)滴加 于殼膜上的生理鹽水迅速滲入。用1 ml注射器滴入2～3滴接種物于絨毛尿囊膜上。最后用透 明膠紙封住卵窗,或用玻璃紙蓋于卵窗上,周?chē)恳匀刍氖灻芊庵�。氣室中央的小孔可�?石蠟密封住。雞胚在接種后,橫臥于孵卵箱中,不許翻動(dòng),保持卵窗向上。絨毛尿囊膜接種 的另一種方法是在氣室端的卵殼上開(kāi)約15cm×15cm的口,并小心地用滅菌眼科鑷子撕去 一小片內殼膜,切勿損傷其下的絨毛尿囊膜,隨即滴入接種物,最后用透明膠紙封閉開(kāi)口。
2.尿囊腔接種 主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病 毒的分離和增殖,也是制備馬 腦炎病毒疫苗的常用接種途徑。選用10～11日齡的雞胚,畫(huà)出氣室和胚位,在氣室接近胚位處 涂抹碘酊和酒精進(jìn)行消毒后,用鋼錐穿一小孔,隨后將注射器針頭沿此小孔插入05～10cm 處 (避開(kāi)血管),注入01～02ml接種物。最后用石蠟封口,并置孵卵箱中孵育。每天翻卵并檢 卵 一次。24小時(shí)內死亡者廢棄。但如上述,東方型和西方型馬腦炎病毒�？稍诮臃N后的15～24 小時(shí)內致死雞胚。另一個(gè)方法是在胚位附近沒(méi)有血管處穿孔并注入接種物,但此時(shí)必須將 氣室端稍向下傾,否則接種液甚至尿囊液可能從針孔中回溢出來(lái)。蠟封的方法同前。
3.卵黃囊接種主要用于蟲(chóng)媒披膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。用6～ 8 日齡雞胚,畫(huà)出氣室和胚胎位置后,垂直放置在固定卵座上,用碘酊和酒精消毒氣室端,以鋼 錐在氣室中央錐一小孔,用滅菌注射器吸取含病毒懸液,沿氣室端所穿小孔剌入約3cm,注入0 1～05ml接種物于卵黃囊內。隨后用溶化的石蠟封孔,置孵卵箱內繼續孵育,每天翻卵1～2 次 。24小時(shí)內死亡者廢棄,但東方型和西方型馬腦炎病毒可能在接毒后15～24小時(shí)內致死雞胚 。
4.羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖。在由病料初次分離病毒時(shí) ,羊膜腔接種法比尿囊腔接種法敏感。但此法操作技術(shù)比較困難,雞胚也易受傷致死。選用11 ～12日齡的雞胚,按絨毛尿囊膜接種法造成人工氣室,撕去卵殼,并剌破絨毛尿囊膜血管較少 的部位,用鈍端鑷子沿此破孔插入,夾起羊膜囊,注入01～02ml接種物。由于不易判斷接 種 物是否被正確地注入羊膜腔內,故可將已經(jīng)吸取了接種物的注射器的筒栓稍微回抽,使注射針 芯內含一個(gè)氣泡。注射時(shí)將氣泡和接種物一起注入。將卵適當倒轉,即可清楚地看到氣泡是 否 在羊膜腔內,以判定注射是否正確。另一個(gè)方法是在氣室端中央開(kāi)一個(gè)12cm直徑的圓孔 。 用滅菌鑷子揭去卵窗部位的卵殼和殼膜,并滴加1滴滅菌液體石蠟于內層殼膜上,使其透明。 如置檢卵燈上觀(guān)察,看得更加清楚。隨后用滅菌彎頭眼科鑷子,剌破內層殼膜和絨毛尿囊膜( 避開(kāi)血管!)并輕輕夾起羊膜使成傘狀,并在直視下將注射針頭插入羊膜腔內,直到碰著(zhù)雞胚或 看到胚胎突然向后退縮,證明針頭已經(jīng)到達羊膜腔內,即可進(jìn)行接種。接種病毒后的雞胚, 一般放37℃孵育,也有少數病毒如流感病毒則放置于33～35℃。除接種馬腦炎病毒外,在24小 時(shí)內死亡的雞胚均視作非特異死亡而廢棄。培養時(shí)間也隨病毒種類(lèi)而異(參見(jiàn)病毒各論)。根 據接種途徑的不同,收獲相應的材料:絨毛尿囊膜接種者,收獲接種部絨毛尿囊膜并注意觀(guān)察 病變;尿囊腔接種者, 收獲尿囊液(5～8ml),并于收獲前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時(shí)以 上,凍死胚胎,防止出血;卵黃囊接種者,收獲卵黃囊或胚體;羊膜腔接種者,收獲羊水(05～1 ml)。獸醫病毒學(xué)實(shí)驗中,除常用雞胚外,有時(shí)也用鴨胚、鵝胚、火雞胚和鵪鶉胚等進(jìn)行病 毒分離、弱毒株培育、疫苗制造以及卵黃抗體生產(chǎn)等。鴨和火雞的孵化期為28天,比21天孵 化期的雞胚更有利于慢病毒的增殖。
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