白玉蘭組織培養中的褐化控制
錄入時(shí)間:2009-6-22 16:48:23
來(lái)源：海博
摘要：為探討白玉蘭組織培養中抑制褐化的方法，以白玉蘭芽為試材，利用組織培養方法，研究了光照、取材季節、預處理、抗氧化劑、吸附劑等條件對褐化的影響。結果表明：黑暗培養有利于抑制褐化；冬季和春季取材褐化率較低，夏季取材褐化率較高；接種前分別用1000mg/L檸檬酸和1000mg/L硫代硫酸鈉預處理外植體可防止褐化；向培養基中添加低濃度NA2S2O3，檸檬酸，聚乙烯毗咯烷酮（PvP ) ，維生素C ( Vc ）能有效降低褐化率。
關(guān)鍵詞：白玉蘭；組織培養；褐化控制
白玉蘭為木蘭科木蘭屬植物，花繁而大，美觀(guān)典雅，清香遠溢，是優(yōu)良的觀(guān)賞樹(shù)種，常用于園林設計、庭院栽培等。白玉蘭一般通過(guò)嫁接、壓條、扦插法繁殖，但成苗率低，速度慢，數量少，成本高，栽培和擴大利用存在很大困難�？衫媒M織培養方式進(jìn)行繁殖。但在組織培養過(guò)程中，容易發(fā)生褐化，致使組織培養的效率不高。有研究表明，褐化主要是由于多酚氧化酶將植物體內酚類(lèi)化合物氧化形成醌而引起的�？刂蒲趸瘲l件，如改變光照強度可以減輕褐化。用抗氧化劑對外植體進(jìn)行預處理、向培養基中添加抗氧化劑、吸附劑等能夠抑制外植體褐化。目前，褐化是限制白玉蘭大規模組織培養的主要因素，而關(guān)于白玉蘭褐化的相關(guān)研究較少，為此，筆者研究了光照條件、取材季節、預處理、培養基中添加抗氧化劑、吸附劑對白玉蘭組織培養中褐化的影響，旨在探討有效抑制白玉蘭外植體褐化的方法。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗材料為白玉蘭芽，長(cháng)度為2 cm ，采自河北科技師范學(xué)院內4 年生，生長(cháng)良好的白玉蘭植株。
1.2 試驗方法
1.2.1 材料消毒與接種 將白玉蘭芽先用洗潔精水浸泡20min ，再用流水沖洗lh ，在超凈工作臺上用體積分數為0.75 的酒精進(jìn)行表面消毒30s，然后用體積分數為0.001 的升汞處理7~8min，再用無(wú)菌水沖洗4~5 次，最后用無(wú)菌吸水紙吸去材料表面的水分，接種到相應的培養基上。
1.2.2 培養基 基本培養基為MS + 0.5mg/L6-BA + 0.3 mg / L IBA 。
1.2.3 培養條件 培養溫度為25 ℃ 土0.5 ℃ ，每天光照llh ，光照度2500h 或暗處理。1 , 2 , 4 取材季節分別于春季（4 月5 日）、夏季（6 月5 日）、冬季（11 月15 日）取材。冬季取植株上的枝條，在室內用0.25 mg / L 的GA3 催芽，使其逐漸解除休眠，待芽長(cháng)度為2 cm 時(shí)接種。
1.2.5 藥劑預處理將白玉蘭芽分別在1 000 mg/L Na2S2O3, 1000mg/L 檸檬酸中浸泡6h ，然后消毒接種到基本培養基中。
1.2.6 培養基中添加藥劑將4 月5 日采取的白玉蘭芽分別接種于附加不同種類(lèi)的抗氧化劑、吸附劑的基本培養基中（表1 ) ，觀(guān)察藥劑對白玉蘭褐化的影響。
1.3 試驗設計與統計分析
每個(gè)處理接種8 瓶，每瓶接2 個(gè)芽，重復3 次。接種15d 調查白玉蘭芽的褐化和生長(cháng)狀況，計算褐化率。試驗采用完全隨機設計，試驗結果采用DPS 統計軟件進(jìn)行分析。
2 結果與分析
2.1 不同光照條件對白玉蘭褐化的影響
分別在光照和黑暗條件下培養，白玉蘭芽都發(fā)生褐化，但褐化程度不同（表2 ）。黑暗條件下，褐化程度較輕，外植體有一定生長(cháng)，但較緩慢，褐化率為33.3 % ；而在正常光照條件下，褐化嚴重，部分外植體褐化死亡，褐化率為60 % ，極顯著(zhù)高于黑暗條件。由此表明，黑暗培養對抑制白玉蘭芽褐化有一定作用。
2.2 取材季節對白玉蘭褐化的影響
不同季節的白玉蘭芽褐化程度不同（表3 ）。夏季（6 月5 日）取材的褐化率為60 % ，顯著(zhù)高于春季( 4 月5 日）和冬季（11 月巧日）取材的。從芽的狀態(tài)來(lái)看，春季和冬季取材的生長(cháng)狀態(tài)好于夏季取材的。由此可見(jiàn)，從控制褐化的角度來(lái)考慮，白玉蘭不宜在夏季取材進(jìn)行組織培養。
2.3 抗氧化劑預處理外植體對白玉蘭褐化的影響
白玉蘭芽通過(guò)抗氧化劑預處理6h ，對抑制褐化有一定作用（表4 ）。兩種藥劑處理的褐化率均低于對照（清水）。用1000mg/L 檸檬酸處理效果比較好，褐化率為10 % ，外植體長(cháng)勢好，有新芽出現；用1000mg/LNa2S2O3處理褐化率為30 ％。
2.4 培養基中添加抗氧化劑、吸附劑對白玉蘭褐化的影響
在MS + 0.5mg/L6-BA + 0.3mg/L IBA 培養基中添加適宜濃度的抗氧化劑、吸附劑有利于抑制白玉蘭褐化。由表5 中處理1 一處理7 可以看出：添加低濃度（<500mg/L ）的Na2S2O3能抑制白玉蘭芽褐化，而且促進(jìn)外植體生長(cháng)，其中50~100mg/L 為最佳濃度，濃度過(guò)高則不能抑制褐化。處理8~處理11 可以看出：向培養基中添加低濃度（<500mg/L ）的檸檬酸能有效抑制白玉蘭芽的褐化，其中添加200mg/L 檸檬酸的效果最佳，白玉蘭褐化率為O 。處理12 一處理15 可以看出：向培養基中添加低濃度(200mg/L ）的PVP 能抑制白玉蘭芽的褐化，但高濃度PVP 不能抑制褐化。處理16 一處理19 看出：向培養基中添加低濃度（lmg/L ）的vc 能抑制白玉蘭芽的褐化，但Vc濃度過(guò)高反而不能抑制褐化發(fā)生。在所選用的抗氧化劑、吸附劑中，Na2S2O3和檸檬酸抑制白玉蘭褐化的效果好于PvP 和Vc。3 結論與討論
3.1 黑暗培養可抑制白玉蘭外植體褐化
將白玉蘭在黑暗條件下培養其褐化率顯著(zhù)低于光照條件的。這一結果與其它植物上的研究一致。組織培養中，褐化是由于植物體內含有的酚類(lèi)物質(zhì)在酚氧化酶的作用下被氧化為棕褐色的醒類(lèi)物質(zhì)，醒又經(jīng)過(guò)非酶促聚合形成黑褐色物質(zhì)，從而毒外植體。酚類(lèi)化合物合成和氧化過(guò)程中，需要許多酶的參與，其中有一部分酶的活性是受光誘導的，如多酚氧化酶（PPO ）在光照條件下活性提高。因此，黑暗培養可以抑制酶活性，從而減輕白玉蘭外植體褐化程度。
3.2 春季、冬季取材可減輕白玉蘭外植體褐化
由于春季、冬季白玉蘭植株體內代謝活動(dòng)較弱，其細胞內參與氧化反應的多酚氧化酶活性較低，因此，這兩個(gè)季節取材褐化率較低；而夏季白玉蘭生長(cháng)旺盛，內部生理活性增強，其褐化程度嚴重。這一結果與張明麗等的研究一致。
3.3 接種前用抗氧化劑對外植體進(jìn)行預處理可減輕其褐化
用抗氧化劑進(jìn)行材料的預處理或預培養可預防酚類(lèi)物質(zhì)的形成。本次試驗利用1000mg/L 檸檬酸，Na2S203 浸泡白玉蘭外植體有效降低了褐化率�？寡趸瘎┠芮宄捎谕庵搀w機械損傷而滲出的酚類(lèi)物質(zhì)和已被酚酶氧化的醒類(lèi)物質(zhì)，減輕褐化危害的作用。
3.4 培養基中添加抗氧化劑、吸附劑可減輕白玉蘭外植體褐化
很多研究表明，培養基中添加抗氧化劑、吸附劑能減輕植物組織培養中外植體的褐化。本次試驗發(fā)現，向培養基中添加低濃度的Na2S2O3，檸檬酸，PvP , vc 能有效抑制白玉蘭褐化；Na2S2O3，檸檬酸的抑褐效果好于PvP ,Vc。
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