抗病毒感染育種��

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動(dòng)物抗病毒育種包括兩個(gè)方面的內容：一是應用常規育種技術(shù)，篩選自然存在的 抗病個(gè)體或 品系，通過(guò)有計劃的選配和選育，培育一些抗病毒動(dòng)物新品系；二是采用基因工程手段，即 是利用DNA重組技術(shù)，克隆和構建抗病毒基因，并通過(guò)轉基因手段導入動(dòng)物種系染色體內 ，構建轉基因動(dòng)物，再結合常規育種技術(shù)，培育抗病毒動(dòng)物新品系。��[BT3](一) 常 規抗病毒感染育 種�コＲ幙共《居�種技術(shù)已在家禽實(shí)踐上取得了一定的成功。雞馬立克氏病(MD) 是雞最常見(jiàn)的淋巴 組織增生性疾病，本世紀三十年代在全世界養雞地區廣泛流行，危害嚴重，隨后有所平熄。 到了六十年代初，強毒力的馬立克氏病病毒再度出現并廣泛流行。分析馬立克氏病流行特點(diǎn) 后發(fā)現，雞體的遺傳結構與馬立克氏病的易感性密切相關(guān)，在遺傳上對馬立克氏病毒具有較 大抵抗力的雞，還具有成熟早、產(chǎn)蛋高等特點(diǎn)。通過(guò)抗病育種篩選，可以達到通過(guò)遺傳控制 疾 病的效果。Hutt和Cole在三十年代初開(kāi)始的工作，奠定了遺傳選擇控制疾病的基礎。�ゲ煌� 品系雞間在馬立克氏病易感性方面存在著(zhù)很大的差異�，F已人工選育并維持了幾個(gè)對馬立克 氏病(ND)具有遺傳抵抗力的品系。選育方法有兩種，其一是利用后裔檢測法或用感染種雞群 的幸存者進(jìn)行繁殖，培育的抗病品系中易感雞少于5%，而未經(jīng)選育群體中易感雞達50%以上 。 國內李康然(1993年)已建立了500羽的抗病核心群。另一種選育方法以血型為基礎，依賴(lài)于M D抵抗力與B21之間的密切相關(guān)。�ビ捎诿庖唠u群與非免疫雞群對MD的抵抗力改變并不 完 全一致，有人建議抗MD雞群的選育應在免疫雞群中進(jìn)行，但目前的選育工作多是在非免疫雞 群中開(kāi)展。�ルu白血病/肉瘤是由禽反轉錄病毒引起的禽類(lèi)多種腫瘤性疾病的總稱(chēng)，這類(lèi)疾 病 的發(fā)生與宿主的基因組成有關(guān)。在人工選育時(shí)，未知父母代的基因型可以通過(guò)其子代與設定 亞群呈隱性的試驗雞進(jìn)行交配，根據特殊的交配試驗中易感性和抵抗性子代的分離，即可確 定未知父母代的基因型。子代表型的鑒別，可以經(jīng)過(guò)尿膜接種勞斯肉瘤病毒(RSV)進(jìn)行痘斑 計數將雞胚分為易感性和抗性雞胚或將RSV接種雛雞顱腔內，根據死亡存活計數率劃分。 由 于抵抗力可能是由多基因控制的，因此這一方法尚未推廣。��[BT3](二) 基因工程抗病 毒感染育種�� [HT5SS]基因工程抗病毒育種是近年來(lái)提出的新設想，是預防獸醫學(xué)研究的國際前沿領(lǐng) 域，具有十 分重要的學(xué)術(shù)意義和發(fā)展前景，有著(zhù)巨大的潛在經(jīng)濟效益。�セ�因工程抗病毒育種可分為 二 個(gè)階段：首先構建轉基因動(dòng)物，然后以轉基因動(dòng)物為親本進(jìn)行常規育種。目前應用的抗病毒 基因主要有如下幾類(lèi)。��[BT4]1.抗病毒細胞因子及其相關(guān)物質(zhì)的 基因��(1) 細胞因子基因：干擾素(IFN)、白介素(IL)等是動(dòng)物體內的生物活性因子，它們 具有抗病毒、抗腫 瘤及免疫調節等功能。將這些具有抗病或抗病相關(guān)物質(zhì)的基因，經(jīng)體外克隆和構建，導入動(dòng) 物的受精卵內，有可能培育成功具有病毒抗性的轉基因動(dòng)物。目前，IFN轉基因動(dòng)物的培育 研究已在國內外相繼獲得成功，IL也于轉基因鼠體內產(chǎn)生了明顯的生物學(xué)效應。��(2) Mx蛋 白基因：Mx蛋白是由IFN誘導產(chǎn)生并具有明顯抗病毒活性的胞內蛋白。Arheiter等將小鼠Mx1 蛋白的cDNA置于IFN或病毒誘導性啟動(dòng)子的控制下，導入對流感病毒敏感的小鼠受精卵內 ，獲得的轉基因小鼠可以抵抗高劑量甲型流感病毒的攻擊。��(3) IFN受體基因：IFN通過(guò)與 細 胞表面相應受體結合，誘導細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白而實(shí)現其抗病毒作用。研究表明，α�睮FN 和β－IFN通過(guò)同一受體與細胞相結合，因此，可以通過(guò)增加機體細胞表面受體數量， 充分發(fā)揮IFN的間接抗病毒作用。Lutfalla等已經(jīng)克隆獲得人的α－IFN受體基因，并在小鼠 細胞表面實(shí)現表達。研究結果證明，它與α－IFN和β－IFN具有很高的親和性。將該基因導 入動(dòng)物 受精卵， 有可能培育成功IFN高反應性的轉基因動(dòng)物——通過(guò)IFN受體介導增強動(dòng)物的抗病 毒能力。��[BT4]2.病毒結構蛋白基因��應用病毒衣殼蛋白基因進(jìn)行抗病毒轉基因研究，最初報道 于植物。Abel等培育成功了攜帶花葉病毒衣殼蛋白基因的轉基因煙草植株，這些轉基因植株 均表現出延遲發(fā)病的抗病性。Beachy對抗病機制作了探討，認為轉基因植物阻止了病毒RNA 的釋放與表達。�ピ趧�(dòng)物病毒研究方面，尚未見(jiàn)有關(guān)類(lèi)似成功的報道。但Sambrook等將流感 病毒血凝素(HA)基因導入小鼠受精卵，在小鼠的胰β細胞表面HA獲得表達。病毒攻擊后 ，轉基因小鼠產(chǎn)生高滴度的抗HA抗體，說(shuō)明機體并未產(chǎn)生對HA的免疫耐受。它提示我們，利 用病毒保護性抗原基因有希望培育出抗病毒的轉基因動(dòng)物。��[BT4]3.病毒中和性單克隆抗體基因�� 抗體的可變區是與相應抗原進(jìn)行特異結合的部位，即抗體的活性部位。將抗病毒中和性單克 隆抗體的可變區基因通過(guò)反轉錄途徑進(jìn)行克隆，構建表達該區的重組基因，能夠表達該單抗 的有效成分用于治療。如果將該基因導入動(dòng)物受精卵中進(jìn)行種系轉化，培育含該基因的轉基 因動(dòng)物，也將為抗感染育種提供一條新途徑。在這方面，Ye等克隆了抗狂犬病病毒中和性 單 抗可變區基因的研究已初獲成功。��[BT4]4.反義RNA�シ戳xRNA最初發(fā)現于原核生物，它們以自然存 在的方式，通過(guò)堿基配對，特異性地與mRNA結合，阻止mRNA的翻譯，是存在于原核生物中 的 一種基因表達調控因子。后來(lái)，在真核細胞中也發(fā)現了一些類(lèi)似反義RNA作用的RNA小分子。 通過(guò)基因轉移技術(shù)證實(shí)了反義RNA在真核細胞中有抑制或 關(guān)閉mRNA翻譯的功能。研究表明，病毒RNA的不同部位均有一定程度的反義抑制作用。因而 針對不同病毒的基因結構和調控序列設計相應有效的反義表達質(zhì)粒，就可實(shí)現抑制病毒的目 的。�シ戳x核酸抑制病毒復制的試驗雖在培養細胞獲得成功，但仍少見(jiàn)應用于植株和整體動(dòng) 物的報道。據有關(guān)資料介紹，美國一家公司將合成的反義PG(聚乳糜酶)基因轉化西紅柿植株 ，其結出的西紅柿不易軟化，有利于保存和運輸。另?yè)�介紹，美國研究人員正從事應用反義 抑制技術(shù)培育抗白血病轉基因鼠的研究，并已獲得初步成功。我們也證實(shí)了抗豬瘟病毒反義 RNA在培養細胞上對豬瘟病毒的抑制作用并正在開(kāi)展轉基因家兔和轉基因豬的研究。 可見(jiàn)，應用 反義RNA進(jìn)行抗病育種研究，是一個(gè)很有價(jià)值的探索領(lǐng)域。��[BT4]5.Ribozyme��Ribozy me可譯為 核酶，有人稱(chēng)之為基因剪刀，它是一種天然的RNA小分子，這種RNA小分子具有催化RNA切割 反應的功能，可以序列特異性地切割RNA。研究表明，Ribozyme具有決定其切割反應特異性 和切割活性的結構，它們與靶RNA具有對應關(guān)系。因此，只要已知的某種病毒的RNA序列， 就可以設計并合成相應的抗病毒Ribozyme，體外試驗結果表明，人工合成的Ribozyme能夠切 斷動(dòng)物病毒的RNA。目前澳大利亞CSIRO的研 究人員已經(jīng)設想通過(guò)Ribozyme開(kāi)展培育抗病毒轉基因動(dòng)物。Ribozyme抗豬瘟育種在我國也已 開(kāi)展�？磥�(lái)Ribozyme在抗病毒育種方面也有潛在的應用前景。��[BT4]6.MHC等位基因�ゼ粗饕�組織相容性抗原復合體基因。MHC基因是參與調節機體免疫反應的基因群，其中 很多等位基因與病毒性傳染病的抗性有關(guān)。根據MHC基因的表達產(chǎn)物的性質(zhì)與功能不同，可 將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)抗原。其中Ⅱ類(lèi)抗原主要存在于巨噬細胞和B細胞表面，是T細胞的激 活因子，尤其是巨噬細胞表面的Ⅱ類(lèi)抗原，當其與經(jīng)巨噬細胞降解的病原體分子結合后，形 成T細胞的第一激活信號，從而啟動(dòng)細胞和體液免疫反應。動(dòng)物在感染病毒后，能否發(fā)生免 疫反應，主要決定于Ⅱ類(lèi)抗原識別病毒抗原分子，并與之結合的程度。有些動(dòng)物對某種病原 特別易感，原因之一就是缺乏相應的Ⅱ類(lèi)抗原。雞的MHC(即B)編碼基因組分為B－F、B－G和 B－ L三段：其中B－F編碼Ⅰ類(lèi)抗原；B－L編碼Ⅱ類(lèi)抗原；B－G為禽類(lèi)所特有，編碼Ⅳ類(lèi)抗原， 存在 于紅細胞等多種細胞表面，參與免疫調節。最近的研究表明，B－G和B－F都與雞馬立克氏病 ( MD)的抗性有關(guān)。人們正在試圖以具有天然抗MD的B21/B21雞為研究對象，鑒定和分離抗MD基 因。�ビ捎诨�因操作技術(shù)的不斷發(fā)展，目前可以將兩個(gè)或多個(gè)抗病毒基因克隆至同一載體中。將這 樣的多重抗病毒基因導入動(dòng)物體，能使不同抗病毒功能的基因產(chǎn)生協(xié)同作用。如將反義RNA 和Rib ozyme融合在一起，既可阻止病毒RNA的翻譯，又可將病毒RNA切斷，從而大大增強其抗病毒 作用。又如將Mx基因與中和性單抗可變區基因融合在一起，不僅可以發(fā)揮單抗可變區的胞外 0抗病毒作用，而且可以發(fā)揮Mx的胞內抗病毒作用。同樣，反義核酸與中和性單抗可變區 基因融合，既有核酸水平的抗病毒作用，又有蛋白水平的作用�？傊�，隨著(zhù)胚胎學(xué)、分子生 物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，抗病毒感染育種研究將不斷深入并取得進(jìn)展。��