關(guān)于亞病毒

1967～1971年，Diener等在研究馬鈴薯的紡錘形塊莖病時(shí)發(fā)現一種比病毒還  小的侵染性致病因子，命名為類(lèi)病毒。類(lèi)病毒的發(fā)現，在生命與非生命之間增加了一種  新的生命形式——裸露的侵染性RNA分子。類(lèi)病毒既是具有核酸結構與功能的生物大分子  ，又是宿主機體內獨立存在的小分子，在分子生物學(xué)以及生物起源的研究上具有特殊  重要意義。�� 類(lèi)病毒沒(méi)有外殼蛋白，對各種有機溶劑有抵抗力，說(shuō)明也沒(méi)有脂質(zhì)外膜，只是一個(gè)  裸露的RNA分子，易被RNA酶破壞。類(lèi)病毒是246～375nt的單鏈RNA分子，例如馬鈴薯紡  錘塊莖病類(lèi)病毒是由359個(gè)核苷酸組成的一個(gè)閉合環(huán)狀的RNA分子，于自然條件下形成一種獨  特的棍棒狀二級結構。�� 在發(fā)現馬鈴薯紡錘塊莖病類(lèi)病毒以后，又陸續發(fā)現柑桔裂皮病、黃瓜白果病、  菊花矮化病、菊花褪綠斑駁病、椰子壞死病和蛇麻矮化病等的病原體也是類(lèi)病毒。�� 類(lèi)病毒的感染力很高，但大多數呈不顯性感染， 例如11個(gè)科的138種植物能感染馬  鈴薯紡錘形塊莖病類(lèi)病毒，但只有茄科和菊科的10多種植物呈現癥狀。類(lèi)病毒感染  的另一個(gè)特點(diǎn)是潛伏期很長(cháng)，馬鈴薯在侵染紡錘形塊莖病類(lèi)病毒后幾個(gè)月甚至在第  二代才出現癥狀——塊莖呈紡錘形，并嚴重減產(chǎn)。柑桔裂皮病的潛伏期長(cháng)達幾年之久。�� 類(lèi)病毒只出現于植物，但在人和動(dòng)物中存在著(zhù)一類(lèi)被稱(chēng)為亞急性海綿樣腦病的中樞神經(jīng)系統  疾病，包括人的  庫魯病(Kuru) 和克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob)以及羊的癢疫、貂的傳染性腦病和  近年發(fā)現的牛海綿狀腦病(又稱(chēng)瘋牛病)等。其中對癢疫的研究最為深入。這些疾病都  有很長(cháng)的潛伏期，并引起類(lèi)似的腦病變，包括灰質(zhì)空泡化和星形細胞增生。宿主缺  乏特異免疫反應是這些疾病的另一特征。近年研究證明，這幾種奇特疾病的病  原，既不是病毒，也不是類(lèi)病毒。如果不完全是，也大體上是由蛋白質(zhì)組成，即使含有  核酸，也只是30bp以下的小分子核酸片段，而且這些核酸片段似乎與這些病原的感染性沒(méi)有  直接關(guān)系，故稱(chēng)“朊” 病毒(virino)。�コ�類(lèi)病毒和“朊”病毒外，還有一種由單鏈、雙  鏈RNA或DNA組成的亞病毒，因其必須依賴(lài)宿主細胞內共感染的輔助病毒才能復制，故稱(chēng)衛星  因子。��亞病毒的發(fā)現，使人類(lèi)對疾病病原的認識進(jìn)入  了一個(gè)新階段，深入研究它們的復制和致病機理，必將導致生物學(xué)界許多新理論和新學(xué)說(shuō)  的出現。本書(shū)將在第三十九章詳加闡述。�� 〖BT2〗六、病毒和病毒成分的細胞外增殖�� 病毒是專(zhuān)性寄生物，不能在細胞外獨立增殖。但于實(shí)驗室內，人們已經(jīng)能夠在無(wú)細胞條 件下進(jìn)行病毒和病毒成分的合成，不僅標志人類(lèi)對病毒增殖的本質(zhì)有了充分的了解，而 且可能進(jìn)一步完全控制病毒體外合成的每一個(gè)細節。�� 寡核苷酸合成和連接方法、聚合酶鏈反應(PCR)以及mRNA體外翻譯系統的建立，為病毒 核酸和蛋白質(zhì)的合成提供了十分有效的手段，本書(shū)將在有關(guān)章節內介紹這些技術(shù)。�� 〖BT4〗1.無(wú)細胞條件下的病毒蛋白合成�� 由于病毒核酸都是多順?lè )醋拥?polycistronic)，故在感染細胞內常由一個(gè)病毒DNA分子 產(chǎn)生出許多個(gè)mRNA。如系RNA病毒，病毒RNA也將編碼出若干不同的蛋白質(zhì)。因此，很難 在體外合成某一種特殊的病毒蛋白。無(wú)細胞條件下的病毒蛋白合成，最先成功于RNA噬 菌體。先用酚抽提法由噬菌體提取RNA(作為mRNA)，同時(shí)應用稀鹽法和離心澄清法由大 腸桿菌提取核糖體。將核糖體與病毒RNA混合，加入三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鳥(niǎo)苷 (GTP)以及磷酸丙酮酸和丙酮酸激酶等，再加氨基酸，置于內含鎂離子和氯化鉀的Tris 緩沖液中，25～35℃溫育30分鐘，常即出現病毒蛋白。此后，即可應用三氯醋酸法將新 合成的病毒蛋白沉淀出來(lái)，也可應用DEAE-纖維素或葡聚糖柱分離，進(jìn)行鑒定。�� 也曾在體外由某些動(dòng)物病毒，例如腺病毒、乳多空病毒、痘苗病毒以及副流感病毒、呼 腸孤病毒和水皰性口炎病毒等的mRNA或RNA，在有細胞抽提物的條件下翻譯出病毒蛋白。�� 〖BT4〗2.無(wú)細胞條件下的病毒核酸合成�� 最先合成成功的病毒核酸是噬菌體的RNA，也是先用酚抽提法由噬菌體提取RNA，作為模 板。另從感染細胞提取復制酶，并用密度梯度離心沉淀法和色譜法加以提純。將RNA和 復制酶混合，置于內含鎂離子的Tris緩沖液中，并加入幾種三磷酸核苷，如ATP、GTP、 CTP和UTP。30℃溫育30～60分鐘，即可產(chǎn)生新的噬菌體RNA。�� 由于動(dòng)物病毒的RNA比噬菌體的RNA大得多，所以很難在抽提和溫育過(guò)程中保證其模板完 整性。但在流感病毒、呼腸孤病毒以及水皰性口炎病毒，已在體外發(fā)現其依賴(lài)RNA的RNA 聚合酶的核酸合成活性。Ehrenfeld等曾在感染HeLa細胞內分離獲得脊髓 灰質(zhì)炎病毒的RNA聚合酶，可以用于脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA的體外合成。在某些RNA動(dòng)物病 毒，病毒粒子上結合有病毒特異的RNA聚合酶，就可直接應用這樣的病毒粒子在上述條 件下體外進(jìn)行病毒核酸合成。�� 〖BT4〗3.無(wú)細胞條件下病毒粒子的合成�� 病毒mRNA在最適離子濃度下與正常細胞漿內的某些成分發(fā)生反應之后，就可以形成新的 感染性病毒粒子。小RNA病毒核酸具有mRNA活性，最易在無(wú)細胞條件下合成病毒，本節 即以小RNA病毒為例說(shuō)明無(wú)細胞條件下的病毒合成。�� 脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA(或人工合成的感染性cDNA)在依賴(lài)RNA的RNA聚合酶(或依賴(lài)DNA的RNA 聚合酶)作用下，可以大量復制新的RNA分子。這種RNA分子與核糖體、tRNA等混合后， 即能產(chǎn)生出病毒蛋白。病毒衣殼蛋白VP0、VP1和VP3都有獨特的對稱(chēng)性構型。在自然條 件下，通過(guò)疏水性基團的相互吸引，形成初聚體(protomer)。許多初聚體又規律性地組 合成2∶3∶5對稱(chēng)的衣殼。應用基因工程技術(shù)表達出來(lái)的病毒蛋白，常在體外自發(fā)形成空 衣殼顆粒。病毒RNA分子究竟是在衣殼形成的同時(shí)進(jìn)入，還是在衣殼形成之后再行入殼， 有待于進(jìn)一步闡明。�� 病毒粒子的形成過(guò)程伴隨著(zhù)病毒蛋白和病毒核酸構型的變化。在VP0自行裂解為VP2和 VP4時(shí)，蛋白構型的變化最為明顯。這一空間構型的變化是不可逆轉的。病毒粒子此時(shí) 變得堅固了，成為所謂的“成熟病毒”。�� 研究證明，病毒體外合成需要許多細胞成分和特定的條件。除必需的核糖體和tRNA等外， 還需某些完整的胞膜以及一定的離子濃度乃至溫度。

 

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