檢測微生物生長(cháng)的方法

一、生長(cháng)量測定法
1、體積測量法：又稱(chēng)測菌絲濃度法。
    通過(guò)測定一定體積培養液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(cháng)狀況。方法是：取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時(shí)間（如5分鐘）和轉速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(cháng)的一個(gè)重要監測指標。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養物，結果會(huì )有一定偏差。
2、稱(chēng)干重發(fā)法：
    可用離心或過(guò)濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時(shí)間和轉速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在1050C或1000C下烘干，或采用紅外線(xiàn)烘干，也可在800C或400C下真空干燥，干燥后稱(chēng)重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在400C下進(jìn)行真空干燥。稱(chēng)干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
3、比濁法：
    微生物的生長(cháng)引起培養物混濁度的增高。通過(guò)紫外分光光度計測定一定波長(cháng)下的吸光值，判斷微生物的生長(cháng)狀況。對某一培養物內的菌體生長(cháng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時(shí)測定其生長(cháng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(cháng)監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計，在波長(cháng)600nm 處用比色管定時(shí)測定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長(cháng)及誘導時(shí)間。
4、菌絲長(cháng)度測量法：
   對于絲狀真菌和一些放線(xiàn)菌，可以在培養基上測定一定時(shí)間內菌絲生長(cháng)的長(cháng)度，或是利用一只一端開(kāi)口并帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，臥放，在開(kāi)口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(cháng)長(cháng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(cháng)。
二、微生物計數法
1、血球計數板法:
   血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺，兩嵴的表比兩平臺的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺上刻有不同規格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀(guān)察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡(jiǎn)便，直觀(guān)，快捷，但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。
2、染色計數法：
   為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀(guān)察計數，而直接用血球計數板法又無(wú)法區分死細胞和活細胞的不足，人們發(fā)明了染色計數法。借助不同的染料對菌體進(jìn)行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀(guān)察，活細胞為無(wú)色，而死細胞為藍色。
3、比例計數法：
  將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標準。
4、液體稀釋法：
   對未知菌樣做連續十倍系列稀釋?zhuān)�根據估計數，從最適宜的三個(gè)連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養液的試管中，經(jīng)培養后記錄每個(gè)稀釋度出現生長(cháng)的試管數，然后查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
5、平板菌落計數法：
   將待測菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)�取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液涂布于已凝固的固體培養基平板上。保溫培養后，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時(shí)將菌液中的細菌進(jìn)行了一次分離培養，獲得了單克隆。
6、試劑紙法：
   小型商品化產(chǎn)品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測試菌液后置密封包裝袋中培養。短期培養后在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。
7、膜過(guò)濾法：
   用特殊的濾膜過(guò)濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀(guān)察細胞的熒光，活細胞會(huì )發(fā)橙色熒光，而死細胞則發(fā)綠色熒光。
三、生理指標法
    微生物的生長(cháng)伴隨著(zhù)一系列生理指標發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(cháng)量相平行的生理指標很多，它們可作為生長(cháng)測定的相對值。
1、測定含氮量：
   大多數細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過(guò)氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2后即可測出N2的量。
2、測定含碳量：
   將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無(wú)機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長(cháng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(cháng)量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線(xiàn)。
3、還原糖測定法：
   還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過(guò)還原糖的測定可間接反映微生物的生長(cháng)狀況，常用于大規模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(cháng)的常規監測。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。
4、氨基氮的測定：
   方法是：離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(cháng)狀況。
5、其他生理物質(zhì)的測定：
   P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標， 都可用于生長(cháng)量的測定。也可以根據反應前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長(cháng)。如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監測溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細菌的長(cháng)勢。

   
   

 

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