微生物鑒別方法：分子生物學(xué)方法

1、DNA堿基比
   DNA堿基比[（G+C）mol%]，以G+C物質(zhì)的量分數（mol%）表示：
  （G+C）mol%=（G+C）/（A+T+G+C）%
  該比值的變化范圍很大，原核生物變化范圍是20-78%，真核生物的變化范圍為30%-60%。
   目前已經(jīng)測定了大量生物的DNA堿基組成這方便的結論有：①親緣關(guān)系密切而表型又高度相似的微生物應該具有相似的DNA堿基比；不同微生物之間的DNA堿基比差別很大，則表明它們之間親緣關(guān)系疏遠。②DNA堿基比相同或相似的微生物并不一定表明它們之間的親緣關(guān)系就一定相近，這是因為DNA堿基比只是指DNA中4種堿基的含量，并未反映出堿基在DNA分子中的排列順序。③一般認為，DNA堿基比相差超過(guò)5%就不可能是屬于同一個(gè)種，DNA堿基比相差超過(guò)10%可考慮是不同屬。
   DNA堿基比可用化學(xué)方法或物理方法測定。目前比較常用物理方法進(jìn)行測定，尤其是熱變性溫度法。該法是用紫外分光光度計測定DNA的熔解溫度（Tm）。它的基本原理是：首先將DNA溶于一定離子強度的溶液中，然后加熱。當溫度升到一定的數值時(shí)，兩條核苷酸單鏈之間的氫鍵開(kāi)始逐漸被打開(kāi)（DNA開(kāi)始變性）分離，從而使DNA溶液365紫外吸收明顯增加；當溫度高達一定值時(shí)，DNA完全分離成單鏈，此后繼續升溫，DNA溶液的紫外吸收也不再增加。DNA的熱變性過(guò)程（即增色效應的出現）是在一個(gè)狹窄的溫度范圍內發(fā)生的，紫外吸收增加的中點(diǎn)值所對應的溫度稱(chēng)為該DNA的熱變性溫度或熔解溫度。在DNA分子中，GC堿基對之間有3個(gè)氫鍵，而AT堿基對只有2個(gè)氫鍵。因此，若細菌的DNA分子G+C含量高，其雙鏈的結合就比較牢固，使其分離成單鏈則需較高的溫度。在一定離子濃度和一定pH的鹽溶液中，DNA的Tm值與DNA的G+C含量成正比。因此，只要用紫外分光光度計測出一種DNA分子的Tm值，就可以計算出該DNA的G+C含量。
2、核酸的分子雜交
   DNA堿基比相同或相近的微生物，其親緣關(guān)系并不一定相近。這是因為DNA堿基比的相同或相近并不反映堿基對的排列順序相同或相近，而微生物間的親緣關(guān)系主要取決于它們堿基對的排列順序的相同程度。因此，要確定它們之間的親緣關(guān)系就要進(jìn)行核酸的分子雜交試驗，以比較它們之間堿基對序列的相同程度。核酸的分子雜交試驗在微生物分類(lèi)鑒定中的應用主要包括DNA-DNA分子雜交和DNA-rRNA分子雜交等方法。
①DNA-DNA分子雜交：該方法的基本原理是利用DNA雙鏈解離成單鏈（變性），單鏈結合成雙鏈（復性），堿基配對的專(zhuān)一性，將不同來(lái)源的DNA在體外解鏈，并在合適的條件下使單鏈中的互補堿基配對結合成雙鏈DNA。然后根據能生成雙鏈的情況，測定雜合百分比。
    核酸的分子雜交的具體測定方法按雜交反應的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜交兩大類(lèi)，前者在溶液中進(jìn)行，后者在固體支持物上進(jìn)行。在這些方法中，有的需要用同位素標記的DNA，有的則用非同位素標記。在細菌分類(lèi)中，常用固相雜交法進(jìn)行測定。這種方法的大致做法是：將未標記的各微生物菌株的單鏈DNA預先固定在硝酸纖維素微孔濾膜（或瓊脂等）上，再用經(jīng)同位素標記的參考菌株的單鏈DNA小分子片段在最適復性溫度條件下與膜上的DNA單鏈雜交；雜交完畢后，洗去濾膜上未配對結合的帶標記的DNA片段；然后測定各菌株DNA濾膜的放射性強度。以參考菌株自身復性結合的放射性計數值為百分之百，即可計算出其他菌株與參考菌株雜交的相對百分數。這些百分數值即分別代表這些菌株與參考菌株的同源性或相似性水平，并以此數值來(lái)判斷各菌種間的親緣關(guān)系。
②DNA-rRNA分子雜交：DNA中（G+C）mol%測定和DNA-DNA分子雜交方法為微生物種和屬的分類(lèi)鑒定研究開(kāi)辟了新的途徑，解決了以表型特征為依據所無(wú)法解決的一些疑難問(wèn)題。許多研究表明，當兩個(gè)菌株的DNA配對堿基少于20%時(shí)，DNA-DNA分子雜交往往不能形成雙鏈，因而限制了DNA-DNA分子雜交方法在微生物種以上單元分類(lèi)中的應用。當兩個(gè)菌株的DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時(shí)，用DNA-rRNA雜交仍可能出現較高的雜交率，因而可以用來(lái)進(jìn)一步比較關(guān)系更遠的菌株之間的關(guān)系，進(jìn)行屬和屬以上等級分類(lèi)單元的分類(lèi)。DNA-rRNA雜交和DNA-DNA雜交的原理和方法基本相同，都是利用核酸復性的規律。但兩種方法也有差異：
A. 在DNA-rRNA分子雜交中，同位素標記部位在rRNA。
B. DNA-rRNA分子雜交結果是以Tm值來(lái)表示。Tm值越高，表示親緣關(guān)系越近。
③核苷酸序列分析從本章第一節可以看出，16SRNA大分子在生物進(jìn)化研究中起著(zhù)重要的作用。新的細菌分類(lèi)系統與傳統的細菌分類(lèi)體系相比，也存在較多的差異，這主要表現在：
A、改變了細胞壁結構作為親緣關(guān)系劃分的標志之一，如無(wú)細胞壁的支原體，實(shí)際是革蘭氏陽(yáng)性的芽孢梭菌的一個(gè)后代分支。
B、改變了營(yíng)養類(lèi)型作為種系發(fā)生的特征，如光合細菌并非是獨立于非光合種群的進(jìn)化分支，而是每種光合種群都代表了一個(gè)高階的分類(lèi)單元，其后代分支包括非光合細菌。
C、盡管革蘭氏陽(yáng)性細菌是系統發(fā)育關(guān)系密切的一群細菌，但革蘭氏陰性菌卻包括了10個(gè)亞群。
 
   

 

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