BDNF的克隆及pTAT/HA2BDNF重組表達載體的構建—2

2　結果
2.1胎腦總RNA的提取及RT2PCR擴增目的基因　28s、18s及5s3條帶明顯完整且無(wú)降解,A260nm/A280nm為1.79,RNA質(zhì)量
濃度為950mg/L。第1輪PCR產(chǎn)物在電泳圖中1000bp處有特異性條帶,與預期的957bp接近,為包含目的基因的大片段;第2輪PCR擴增產(chǎn)物行電泳時(shí),在750bp處有特異性條帶,與預期的763bp相近,為BDNF目的基因片段,見(jiàn)圖3A-B。
2.2 PTAT/HA2BDNF載體的構建及酶切鑒定
重組質(zhì)粒PTAT/HA2BDNF經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示3.0kb和763bp2個(gè)片斷,3.0kb的片斷為PTAT/HA酶切后的大小,763bp為BDNF基因片斷大小,酶切證實(shí)構建的表達載體PTAT/HA2BDNF是正確的,
2.3 DNA序列測定　經(jīng)測序證實(shí),重組表達載體pTAT/HA2BDNF經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后內插入的堿基組成與GenBank(AF411339)中的人BDNF基因序列完全一致。
3　討論
  自從1989年德國科學(xué)家Leibrock等根據所測出的BDNF部分氨基酸殘基序列設計PCR引物,用RT2CR方法從豬腦mRNA中成功克隆BDNFcDNA以來(lái),BDNF基因的克隆和表達研究取得重大進(jìn)展。但是因為血腦屏障只允許分子量小于600Da的蛋白通過(guò),分子量約13KDa的BDNF不能穿透血腦屏障,這給BDNF用于中樞神經(jīng)系統的治療帶來(lái)困難。TAT白轉導域的發(fā)現及其能穿透血腦屏障的特性,給藥物的應用帶來(lái)希望。為此,本研究構建pTAT/HA2BD2NF載體,以探討TAT攜帶BDNF穿透血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統疾病的可行性。本研究選用的pTAT/HA載體為美國科學(xué)家Nagahara構建的能夠產(chǎn)生高水平TAT融合蛋白的細菌表達子[12],pTAT/HA末端依次編碼6個(gè)組氨酸、TAT蛋白的11個(gè)氨基酸、血球凝集素標記及多克隆位點(diǎn)。組氨酸標簽有利于表達蛋白的純化及免疫學(xué)檢測,血球凝集素標記亦有利于免疫學(xué)檢測,所以pTAT/HA是表達TAT融合蛋白較為理想的載體。本研究采用RT2PCR從胚胎腦組織中克隆BDNF,根據人BDNF的基因序列設計內外側引物,采用巢式PCR擴增目的基因,從而降低擴增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性,提高反應的特異性和靈敏度;將編碼BDNF的DNA序列克隆到表達載體PTAT/HA下游,便于直接表達融合蛋白TAT2BDNF。本研究成功構建原核表達載體pTAT/HA2BDNF,重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定,測序結果表明克隆片段與報道序列同源性達100%,為下一步表達完整、功能性的融和蛋白TAT2BDNF,研究TAT穿透血腦屏障等打下了基礎。
   
   

 

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