PTEN基因轉染對人膀胱癌細胞BIU-287中PI3K2-Akt信號通路的影響_1

  PTEN是迄今為止發(fā)現的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因,它通過(guò)發(fā)揮磷酸酶作用,降低多種信號傳導途徑的關(guān)鍵酶的磷酸化水平,阻斷信號傳導通路,以抑制細胞的生長(cháng)、黏附、鋪展和遷移,誘導凋亡,從而對腫瘤的生長(cháng)、侵襲和轉移產(chǎn)生負性調節作用。PI3K2Akt途徑是蛋白激酶偶聯(lián)受體介導的一條重要的信號轉導通路,細胞外信號分子通過(guò)磷酸化依次激活三磷酸酰肌醇激酶PI3K、蛋白激酶BAkt/PKB及其他下游信號分子,以促進(jìn)細胞的增殖,抑制凋亡并對細胞周期起正調控作用,導致細胞惡性轉化。本實(shí)驗檢測PTEN基因轉染前后膀胱癌細胞P110(PI3K的催化亞單位、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表達情況,以期證明PTEN可能通過(guò)PI3K2Akt信號傳導途徑起抑癌作用。
1、材料與方法
1.1主要材料和試劑　人膀胱癌細胞,pBp2PTEN及pBabe2puro(pBp)空質(zhì)粒,DH5α大腸桿菌菌株。Trizol和大量質(zhì)粒抽提純化試劑盒、限制性?xún)惹忻窫coRⅠ、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、PCR引物、通用RT2PCR試劑盒
1.2細菌的轉化和擴增培養　氯化鈣法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5。于EP管中加入質(zhì)粒和感受態(tài)DH5混勻后至水浴中熱休克,再加入無(wú)抗生素LB培養基孵育。從EP管中取菌液,接種于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上,培養過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落,轉入含氨芐青霉素的LB培養基中,振搖過(guò)夜至飽和生長(cháng),-70℃冰箱保存。
1.3質(zhì)粒的抽提純化和酶切鑒定　取質(zhì)粒轉化的菌液到含氨芐青霉素的LB培養基中,振搖過(guò)夜。按大量質(zhì)粒抽提純化試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟,提取并純化pBp2PTEN或pBp。將純化的質(zhì)粒DNA,于紫外分光光度計上檢測純度,A260/A280=1.8—2符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切DNA片段。
1.4基因轉染和細胞篩選　在6孔板中接種BIU287細胞,培養至滿(mǎn)70%-80%,按脂質(zhì)體Lipo2fectamine2000說(shuō)明書(shū)的步驟,將pBp2PTEN或空質(zhì)粒pBp導入BIU287細胞,轉染24h后換液,并于熒光顯微鏡下觀(guān)察,繼續培養48h,加嘌呤霉素篩選并擴增培養。
1.5RT2PCR提取細胞RNA后,按通用RT2PCR試劑盒步驟進(jìn)行操作。反應條件:94℃預變性5min,94℃變性50s,58℃退火50s,72℃延伸1min,循環(huán)32周,72℃再延伸8min。將pBp2PTEN轉染細胞pBp2PTEN2BIU87、pBp轉染細胞pBp2BIU87和未轉染細胞(BIU287)的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,凝膠分析系統觀(guān)察。
1.6Westernblot制作凝膠SDS2聚丙烯酰胺凝膠后,凝膠板安置于電泳槽,將處理好的樣品加入槽內。電泳后取出凝膠,進(jìn)行半干式電轉移,膠中的蛋白質(zhì)將轉移至膜上。最后行免疫顯色。膜置濾紙上干燥,分析結果。質(zhì)粒鑒定證實(shí)含有PTEN基因,RT2PCR證實(shí)PTEN轉染后穩定表達。三種細胞P110和Akt的Westernblot陽(yáng)性條帶強度相似,提示轉染前后P110和Akt蛋白的總水平無(wú)明顯變化;PTEN轉染后,磷酸化P110和磷酸化Akt的陽(yáng)性條帶明顯較對照組弱,說(shuō)明PTEN轉染導致P110和Akt的磷酸化水平降低   
   

 

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