大腸菌群測定的操作細則

   大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來(lái)評價(jià)食品的衛生質(zhì)量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。 
食品中大腸菌群數系以100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。 
1 設備和材料 
1.1 溫箱：36±1℃。 
1.2 冰箱:0～4℃。 
1.3 恒溫水浴 :44.5±0.5℃。 
1.4 天平。 
1.5 顯微鏡。 
1.6 均質(zhì)器或乳缽。 
1.7 平皿:直徑為90mm。 
1.8 試管。 
1.9 吸管。 
1.10 廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。 
1.11 玻璃珠:直徑約5mm。 
1.12 載玻片。 
1.13 酒精燈。 
1.14 試管架。 
2 培養基和試劑 
2.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管:按GB 4789.28中4.9規定。 
2.2 伊紅美藍瓊脂平板:按GB 4789.28中4.25規定。 
2.3 乳糖發(fā)酵管:按GB 4789.28中4.10規定。 
2.4 EC 肉湯:按GB 4789.28中4.11規定。 
2.5 磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB 4789.28中3.22規定。 
2.6 生理鹽水。 
2.7 革蘭氏染色液:按GB 4789.28中2.2規定。 
3 操作步驟 
3.1 檢樣稀釋 
3.1.1 以無(wú)菌操作將檢樣25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jì)?瓶?jì)扔柚眠m當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器,以8 000-10 000 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。 
3.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。 
3.1.3 另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。 
3.1.4 根據食品衛生標準要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度,接種3管。 
3.2 乳糖發(fā)酵試驗 
將待檢樣品接種于乳糖 膽鹽發(fā)酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃ 溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行。 
3.3 分離培養 
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃ 溫箱內,培養18-24h,然后取出,觀(guān)察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗。 
3.4 證實(shí)試驗 
在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,置 36±1℃溫箱內培養24±2h,觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。 
3.5 報告 
根據證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。 
4 糞大腸菌群(faecal coliform) 
4.1 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養物(見(jiàn)3.2條)轉種于EC肉湯管內,置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高于EC肉湯液面),培養24±2h,經(jīng)培養后,如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣,則可報告為陰性;如有產(chǎn)氣者,則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上,置 培養18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。 
4.2 結果報告 
根據證實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。

 

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