實(shí)驗二十五 微生物的分離和純化

一、基本原理
　　在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類(lèi)的微生物絕大多數都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類(lèi)群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養，這種獲得純培養的方法稱(chēng)為微生物的分離與純化。
　　為了獲得某種微生物的純培養，一般是根據該微生物對營(yíng)養、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(cháng)，而抑制其他菌生長(cháng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線(xiàn)分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。
　　土壤是微生物生活的大本營(yíng)，在這里生活的微生物無(wú)論是數量和種類(lèi)都是極其多樣的，因此，土壤是我們開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。
二、器材
　　高氏1號瓊脂培養基，肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，接種環(huán)，10％酚，無(wú)菌培養皿，鏈霉素，土樣等。
三、操作步驟
　　1．稀釋涂布平板法
　�。�1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養基、高氏1號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基溶化，待冷至55—60℃時(shí)，向高氏1號瓊脂培養基中加入10％酚數滴，向馬丁氏培養基中加入鏈霉素溶液，使每毫升培養基中含鏈霉素30μg。然后分別倒平板，每種培養基倒三皿，其方法是右手持盛培養基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出，如果試管內或三角燒瓶?jì)鹊呐囵B基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養皿，使培養基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開(kāi)培養皿，再注入培養基，搖勻后制成平板，如圖Ⅶ-1所示。最好是將平板放室溫2—3天，或 37℃培養24小時(shí)，檢查無(wú)菌落及皿蓋無(wú)冷凝水后再使用。
　�。�2）制備 土壤稀釋液稱(chēng)取土樣10g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類(lèi)推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。
　�。�3）涂布 將上述每種培養基的三個(gè)平板底面分別用記號筆寫(xiě)上10-4、10-5和10-6三種稀釋度，然后用三支1ml無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0．2ml對號放入已寫(xiě)好稀釋度的平板中，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻，如圖Ⅶ-2所示。
　�。�4）培養 將高氏1號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置于28℃溫室中培養3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養2—3日�！�
　�。�5）挑菌 將培養后長(cháng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養，待菌苔長(cháng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養。整個(gè)分離過(guò)程見(jiàn)圖Ⅶ-3。
　　2．稀釋混合平板法
　　此法與稀釋涂布平板法基本相同，無(wú)菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取0．5ml10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對號放入平皿，然后再倒入溶化后冷卻到45℃左右的培養基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養基混合均勻，待冷凝成平板后，分別倒置于28℃和37℃溫室中培養后，再挑取單個(gè)菌落，直至獲得純培養。
　　3．平板劃線(xiàn)分離法
　�。�1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養基名稱(chēng)。
　�。�2）劃線(xiàn)在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線(xiàn)（圖Ⅶ-4）。劃線(xiàn)的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線(xiàn)，其目的都是通過(guò)劃線(xiàn)將樣品在平板上進(jìn)行稀釋?zhuān)�使形成單個(gè)菌落。常用的劃線(xiàn)方法有下列二種：
　�。╝）用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養基的一邊作第一次平行劃線(xiàn)3—4條，再轉動(dòng)培養皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線(xiàn)部分作第二次平行劃線(xiàn)，再用同法通過(guò)第二次平行劃線(xiàn)部分作第三次平行劃線(xiàn)和通過(guò)第三次平行劃線(xiàn)部分作第四次平行劃線(xiàn)（圖Ⅶ-5，A）。劃線(xiàn)完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養。
　�。╞）將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養基上作連續劃線(xiàn)（圖Ⅶ-5，B）。劃線(xiàn)完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養。
　�。�3）挑菌 同稀釋涂布平板法，一直到菌分純?yōu)橹埂?br>四、實(shí)驗報告   
   

 

上一篇：微生物的純培養

下一篇：實(shí)驗二十六 微生物的培養特征