實(shí)驗七 革蘭氏染色法

一、基本原理
　　革蘭氏染色反應是細菌分類(lèi)和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫師Gram創(chuàng )立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀(guān)察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區分為兩大類(lèi)：染色反應呈藍紫色的稱(chēng)為革蘭氏陽(yáng)性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱(chēng)為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽(yáng)性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成的，在染色過(guò)程中，當用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類(lèi)物質(zhì)含量高，當用乙醇處理時(shí)，脂類(lèi)物質(zhì)溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。
　　革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復染液（counterstain）。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫（crystal violet）。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著(zhù)力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，碘（iodine）是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細胞進(jìn)行脫色，不同類(lèi)型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精（ethanol）。復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區分成G+和G-兩大類(lèi)群，常用的復染液是番紅。
二、器材
　　大腸桿菌，枯草芽孢桿菌；
　　革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等。
三、操作步驟
1．涂片將培養14—16小時(shí)的枯草芽孢桿菌和培養24小時(shí)的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過(guò)于濃厚），干燥、固定。固定時(shí)通過(guò)火焰1—2次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。
2．染色
（1）初染 加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。
（2）媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。
（3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。
（4）復染 用番紅液染1—2分鐘，水洗。
（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀(guān)察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的細菌的革蘭氏染色反應為準，過(guò)于密集的細菌，常常呈假陽(yáng)性。
（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。
　　革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽(yáng)性菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。
四、實(shí)驗報告   
   

 

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