實(shí)驗五 電子顯微鏡

一、基本原理
1．電子顯微鏡的分辨力和放大率
　　電子顯微鏡是利用電子流代替光學(xué)顯微鏡的光束使物體放大成像而由此得名的。發(fā)射電子流的電子源部分稱(chēng)為電子槍?zhuān)�電子槍由發(fā)射電子的“V”形鎢絲及陽(yáng)極板組成，在高真空中，鎢絲被加熱到白熾程度，其尖端便發(fā)射出電子，發(fā)射出來(lái)的電子受到陽(yáng)極很高的正電壓的吸引，使電子得到很大的加速度而到達樣品。電壓越高，電子流速度越快，波長(cháng)越短，其分辨能力也越強。一般用50—100kV電壓時(shí)，電子波長(cháng)在0．54—0．37nm，所以電子顯微鏡的分辨力極高，可達0．2nm左右，此分辨力比光學(xué)顯微鏡提高了近1000倍。
　　在電子流的通路上不能有游離的氣體分子存在，否則由于氣體分子與電子的碰撞而造成電子的偏轉，導致物像散亂不清。因此，電子顯微鏡除需要高電壓外，還需要高真空的裝置。
　　電子顯微鏡的放大率是由透鏡決定的，在電子顯微鏡中，透鏡是由看不見(jiàn)的電磁場(chǎng)構成的，稱(chēng)為電磁透鏡，簡(jiǎn)稱(chēng)磁透鏡。由電子槍發(fā)射出的電子流可以通過(guò)磁透鏡的磁場(chǎng)吸引發(fā)生偏折而放大物體，這與光學(xué)顯微鏡的光線(xiàn)通過(guò)玻璃透鏡發(fā)生折射而放大物體的情況一樣，但它不同于光學(xué)顯微鏡的是可利用多個(gè)磁透鏡的組合而得到逐級放大的電子像，所以現代電子顯微鏡的成像系統由多個(gè)電磁透鏡組成。而光學(xué)顯微鏡由于玻璃透鏡本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通過(guò)增加透鏡的數目來(lái)無(wú)止境地提高。
　　此外，通過(guò)改變這些電磁透鏡的磁場(chǎng)強度也可提高放大率。磁場(chǎng)越強，焦距越短，放大倍數也就越大。所以現代電子顯微鏡的成像物鏡大多數采用短焦距的強磁透鏡，放大倍數可達一百萬(wàn)倍以上。
　　圖Ⅲ-12表示電子顯微鏡鏡體剖面圖。從圖上可以看到構成電子顯微鏡的主要部件及其位置。
2．電子顯微鏡的成像原理
　　任何一個(gè)物體都是由原子組成的，原子則是由原子核與軌道電子組成的。當電子束照射到樣品上的時(shí)候，一部分電子能從原子與原子之間的空隙中穿透過(guò)去，其余的電子有一部分會(huì )與原子核或原子的軌道電子發(fā)生碰撞被散射開(kāi)來(lái)；一部分電子從樣品表面被反射出來(lái)；還有一些電子是被樣品吸收以后，樣品激化而又從樣品本身反射出來(lái)等。如果把所有這些不同類(lèi)型的電子收集起來(lái)，使它們成像，便可以構成不同類(lèi)型的電子顯微鏡（圖Ⅲ—13）。這里只著(zhù)重介紹透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。
（1）透射電子顯微鏡
　　從圖Ⅲ-13可以看出透射電子顯微鏡收集的是透過(guò)樣品的電子。在透射電子顯微鏡中，物像的形成主要來(lái)自電子的散射作用與干涉作用。散射作用分“彈性散射”和“非彈性散射”兩種。彈性散射指電子和原子核發(fā)生碰撞，電子基本上不損失能量，而只是改變運動(dòng)方向，這種碰撞稱(chēng)為彈性碰撞，這時(shí)候我們說(shuō)電子發(fā)生了“彈性散射”作用。如果電子是和軌道電子發(fā)生碰撞，電子不僅會(huì )改變原來(lái)運動(dòng)的方向，而且還會(huì )損失一部分能量，這時(shí)電子便發(fā)生了“非彈性散射”作用。
　　由于物體上不同部位的結構不同，它們散射電子的能力也各不相同，結果使透過(guò)樣品的電子束發(fā)生疏密的差別，在散射電子能力強的地方，透過(guò)去的電子數目少，因而打在熒光屏上所發(fā)出的光就弱，顯現為暗區；而散射電子能力弱的地方，透過(guò)的電子數目多，打在熒光屏上所發(fā)出的光就強，顯現為亮區，這樣，便在終像上造成了有亮有暗的區域，因而出現了反差，人眼就可以辨別。散射作用形成的反差造成強度上的變化，因此又稱(chēng)為“振幅反差”。由于在電子顯微鏡中利用的是人眼看不見(jiàn)的電子流，所以通常用一塊熒光屏來(lái)把電子流轉換成可見(jiàn)的熒光，使人眼可以接受。
　　除了散射作用能引起反差外，電子的干涉作用也能造成反差，在電子發(fā)生非彈性碰撞的時(shí)候，由于電子會(huì )失去一部分能量，因而使它前進(jìn)的速度變慢，這部分速度減慢的電子會(huì )和速度不變的電子發(fā)生干涉作用，結果造成電子相位上的變化，從而也引起反差，稱(chēng)為“相位反差”。
　　在低倍觀(guān)察時(shí)，振幅反差是主要的反差來(lái)源，而在高倍觀(guān)察時(shí)，也就是在辨別極小的（如1nm大�。┘毼⒔Y構時(shí)，相位反差則起主要作用。
（2）掃描電子顯微鏡
　　與透射電子顯微鏡不同，掃描電子顯微鏡是把從樣品表面反射出來(lái)的電子收集起來(lái)并使它們成像，所以又稱(chēng)反射電子顯微鏡。掃描電子顯微鏡的成像原理與電視或電傳真照片的原理相似，由電子槍產(chǎn)生的電子束經(jīng)過(guò)三個(gè)磁透鏡的作用，形成一個(gè)很細的電子束，稱(chēng)為電子探針。電子探針經(jīng)過(guò)透鏡聚焦到樣品表面上，按著(zhù)順序逐行逐行地通過(guò)樣品，也就是對樣品掃描，然后把從樣品表面發(fā)射出來(lái)的各種電子（二次電子、反射電子等）用探測器收集起來(lái)，并轉變?yōu)殡娏餍盘柦?jīng)放大后再送到顯像管轉變成圖像。
　　掃描電子顯微鏡主要用來(lái)觀(guān)察樣品的表面結構，分辨力可達10nm，放大范圍很廣，可從20倍到幾十萬(wàn)倍。透射電子顯微鏡的分辨力雖然很高，但是一般只能觀(guān)察切成薄片后的二維圖像，掃描電子顯微鏡能夠直接觀(guān)察樣品表面的立體結構，并且具有明顯的真實(shí)感。許多電子無(wú)法透過(guò)的較厚樣品，只能用掃描電子顯微鏡才能看到。
　　光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡以及掃描電子顯微鏡的比較見(jiàn)圖Ⅲ-14。
二、器材
　　銅網(wǎng)若干個(gè)，瓷漏斗，無(wú)菌鑷子，無(wú)菌滴管，大頭針，載玻片，細菌計數板，普通光學(xué)顯微鏡；
　　醋酸戊脂，濃硫酸，無(wú)水乙醇，無(wú)菌水，2％磷鎢酸鈉（pH6．5—8．0）水溶液；
　　大腸桿菌（大腸埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。
三、樣品制備
　　根據電子顯微鏡類(lèi)型的不同，相應地也就有各種不同的樣品制備技術(shù)，本實(shí)驗主要介紹透射電子顯微鏡的樣品制備技術(shù)。
　　由于電子顯微鏡的整個(gè)操作都需要在高真空中進(jìn)行，所以被觀(guān)察的微生物標本必須是干燥的，否則就會(huì )引起菌體細胞發(fā)生收縮變形。同時(shí)又因為電子流的穿透能力很弱，不能透過(guò)載玻片或較厚的標本，所以需要將標本放在由金屬網(wǎng)作支架的火棉膠或聚乙烯甲醛薄膜上觀(guān)察，此膜又稱(chēng)載膜或支持膜（掃描電子顯微鏡可用蓋玻片）。
1．制作支持膜
　　支持膜的厚度一般在15nm左右，太薄會(huì )影響它的機械支持力，太厚
　　又會(huì )影響成像的分辨力。支持膜可用塑料膜（如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鈹膜等）。在常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求。常用的金屬網(wǎng)有銅網(wǎng)和不銹鋼網(wǎng)。本實(shí)驗以銅網(wǎng)火棉膠膜為例說(shuō)明支持膜的制作方法。
（1）銅網(wǎng)的處理 銅網(wǎng)為圓形，直徑一般是2．3或3．0mm，其規格有150、200、250目之分，其中比較常用的是200目（200個(gè)孔）。銅網(wǎng)在制膜前要清洗、脫水，否則會(huì )影響膜的質(zhì)量和標本照片的清晰度。處理方法是先用醋酸戊酯浸漂若干小時(shí)后，用蒸餾水沖洗數次，然后再將銅網(wǎng)浸漂在無(wú)水酒精中進(jìn)行脫水，最后將洗凈的銅網(wǎng)放入瓷漏斗或小培養皿內，漏斗下面套上乳膠管，用止水夾控制水流。然后緩緩向漏斗內放入無(wú)菌水，其量為1cm左右，用無(wú)菌鑷子尖輕輕排除網(wǎng)上的氣泡，并將其均勻地擺在瓷漏斗的中心區域。
　　若銅網(wǎng)經(jīng)以上處理仍不干凈時(shí)，可用稀釋的濃硫酸（1：1）處理1分鐘左右，立即用無(wú)菌蒸餾水沖洗數次，然后放入無(wú)水酒精中脫水。
（2）配制火棉膠 將1．5g火棉膠溶于100ml醋酸戊酯中。
（3）制膜 用無(wú)菌滴管取上述火棉膠液滴在瓷漏斗的水面上，待醋酸戊酯蒸發(fā)，火棉膠則由于水的表面張力隨即在水面上形成一層薄膜（勿振動(dòng)），用鑷子將它除掉，如此操作兩次以清除水面上的雜質(zhì)。然后再適量滴一滴火棉膠液以形成支持膜（火棉膠液滴的多少與膜的厚薄關(guān)系很大，要適量控制）。松開(kāi)止水夾，緩緩放掉漏斗中的水，使膜自然下沉，并緊貼在銅網(wǎng)上，在此過(guò)程中切勿使膜皺折。最后在瓷漏斗上覆蓋一潔凈的紙，讓膜自然干燥。
　　將干燥后的膜用大頭針的針尖在銅網(wǎng)周?chē)鷦澠�，再用無(wú)菌鑷子小心地將銅網(wǎng)膜移到載玻片上，置普通光學(xué)顯微鏡下用低倍鏡檢查，挑選無(wú)皺折、完整無(wú)缺、厚薄均勻的銅網(wǎng)膜備用。
2．制片
　　有許多種制片方法，如直接貼印法、滴液法、負染色法和超薄切片法等。本實(shí)驗介紹負染色法，此法常用來(lái)觀(guān)察病毒粒子、高分子和細菌等。所謂負染色法是將樣品用電子密度高，本身不顯示結構且與樣品幾乎不反應的物質(zhì)（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來(lái)包圍樣品，即不是被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周。如果樣品具有表面結構，這種物質(zhì)還能穿透進(jìn)表面上凹陷的部分，這樣，在有染液的重金屬元素沉積的地方，散射電子的能力強，因而樣品四周表現為暗區；在有樣品的地方散射電子的能力弱，因而表現為亮區。這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來(lái)。具體操作如下：
（1）將適量無(wú)菌水加入生長(cháng)良好的大腸桿菌斜面內，用吸管輕輕撥動(dòng)菌體制成菌懸液。用無(wú)菌濾紙過(guò)濾，并調整濾液中的細胞濃度為每毫升108—109個(gè)。
（2）取等量的上述菌懸液與等量的2％的磷鎢酸鈉水溶液（pH6．5—8．0）混合，制成混合菌懸液。
（3）用無(wú)菌毛細吸管吸取混合菌懸液滴在銅網(wǎng)膜上。
（4）經(jīng)3—5分鐘后，用濾紙吸去余水，待樣品干燥后，先置低倍光學(xué)顯微鏡下檢查，挑選膜完整、菌體分布均勻的銅網(wǎng)置電子顯微鏡觀(guān)察。
　為了保持形狀，常用戊二醛、甲醛、餓酸蒸汽等試劑小心固定后再進(jìn)行染色。其方法是將無(wú)菌水制備好的菌懸液經(jīng)過(guò)濾，然后向濾液中加幾滴固定液（如0．15％的戊二醛磷酸緩沖液，pH7．2），經(jīng)這樣預先稍加固定后，離心，收集菌體，制成菌懸液，再加幾滴新鮮的戊二醛，在室溫或4℃冰箱內固定一夜，次日離心，收集菌體，再用無(wú)菌水制成菌懸液，并調整細胞濃度為每毫升108—109個(gè)，然后按上述方法染色。
四、實(shí)驗報告   
   

 

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