實(shí)驗四 相差顯微鏡

一、基本原理
　　暗視野顯微鏡可以看到活細胞的外部形態(tài)，但是看不清內部結構。相差顯微鏡不僅能觀(guān)察活細胞的形態(tài)，而且還能看到細胞內部結構以及細胞分裂的連續過(guò)程。
　　光線(xiàn)通過(guò)透明物體如活細菌細胞后，由于受透明物體中密度和折射率不同的物質(zhì)的影響，部分光線(xiàn)變成了繞射光，光波的相位發(fā)生變化，而這種相位差不表現為明暗和顏色上的差異，不能在顯微鏡視野中觀(guān)察到。相差顯微鏡就是將經(jīng)過(guò)透明物體的直射光延遲或提前，并和繞射光產(chǎn)生干涉，使相位差變?yōu)檎穹�差。如果產(chǎn)生的干涉為相長(cháng)干涉（圖Ⅲ-8，R組光線(xiàn)），則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分；如果所產(chǎn)生的干涉為相消干涉時(shí)（如圖Ⅲ-8，S組光線(xiàn)），則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位差為振幅差的結果，使原來(lái)透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增加，能更清晰地觀(guān)察活細胞的細微結構。
　　相差顯微鏡成像原理和裝置如圖Ⅲ-9所示。
　　在普通光學(xué)顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：
（1）環(huán)狀光闌
　　相差顯微鏡的聚光鏡光闌是環(huán)狀光闌。照明光線(xiàn)只能從環(huán)狀的透明區進(jìn)入聚光鏡再斜射到標本上（斜射角度遠小于暗視野聚光鏡）。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉盤(pán)（圖Ⅲ-10，A），安裝于聚光鏡下面，更換放大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換與其相應的光闌。
（2）相差物鏡（鏡頭上標有PC或PH字樣）
　　物鏡的后焦平面上裝有相板，這是相差顯微鏡的主要裝置。相板上和環(huán)狀光闌相對應的環(huán)狀部分大多數是涂的吸收膜和推遲相位膜，其他部分完全透明。從標本上射過(guò)來(lái)的光線(xiàn)，繞射光部分穿過(guò)透明區；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分，光強度減弱，相位也適當改變。一般所用的相板推遲相位1/4，吸收80％的直射光，這樣，就使直射光和繞射光的強度接近，而相位差則增大或減少。由于透明標本內部構造的折射率不同，產(chǎn)生繞射光的相位就會(huì )有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。
（3）綠色濾光片
　　為了獲得良好的相差，最好用單色光線(xiàn)照明，一般選用綠色光線(xiàn)。
（4）合軸調整望遠鏡
　　為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線(xiàn)上，必須拔出目鏡，裝上特別的低倍望遠鏡（圖Ⅲ-10，B），使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)合軸（圖Ⅲ-11）。
二、器材
　　相差顯微鏡，1．0mm以下載玻片，0．16-0．17mm以下蓋玻片；釀酒酵母水浸片，枯草芽孢桿菌水浸片�！�
三、操作步驟
1．將釀酒酵母水浸片置載物臺上，夾好。
2．轉動(dòng)聚光器下面的環(huán)狀光闌轉盤(pán)至“0”，并將光圈開(kāi)到最大。
3．通過(guò)普通目鏡和低倍相差物鏡（如10×）調節焦距，看清標本。
4．轉動(dòng)轉換器，使油鏡相差物鏡（90×）對準標本，同時(shí)轉動(dòng)環(huán)狀光闌轉盤(pán)至40，使與所用的物鏡相符。
5．用細調節器調節焦距，使物像清楚。
6．取下目鏡，換上合軸調節望遠鏡，轉動(dòng)望遠鏡使聚光鏡中的亮環(huán)和物鏡中的暗環(huán)看清楚。
7．轉動(dòng)聚光鏡左右二側的調節桿，使兩環(huán)重合。
8．取下望遠鏡換上目鏡進(jìn)行觀(guān)察，每更換標本或改變不同倍數的相差物鏡時(shí)，都必須依上法重新合軸調節。
9．換上枯草芽孢桿菌的水浸片進(jìn)行觀(guān)察（必須先進(jìn)行合軸調節）。
四、實(shí)驗報告   
   

 

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