實(shí)驗三 暗視野光學(xué)顯微鏡

一、基本原理
　　生活的細菌在明視野顯微鏡下觀(guān)察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來(lái)自縫隙的一束強光通過(guò)暗室時(shí)，可清楚地看到其中細微灰塵的現象是一樣的，即給樣品照明的光不直接穿過(guò)物鏡，而是由樣品上反射或折射的光進(jìn)入物鏡，那么，在漆黑的視野中，由于反差增大了，使樣品能夠看得更清楚。因用暗視野法可以在黑暗的視野中看到光亮的菌體，故在觀(guān)察生活細菌及細菌運動(dòng)時(shí)常采用此法。
　　暗視野顯微鏡的構造主要是采用一種特殊的聚光器，在聚光器的下方中央為圓形黑盤(pán)所遮，光僅由周緣進(jìn)入，使光會(huì )聚于載玻片上，并斜照物體，物體經(jīng)斜射照明后，發(fā)出反射光可進(jìn)入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無(wú)暗視野顯微鏡時(shí)，只需將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下面的濾光鏡支架上放一片星形擋板（star diaphragm）（圖Ⅲ-6）構成暗視野，這種方法適用于低倍鏡觀(guān)察。
　　在暗視野中，由于有些活細胞其外表比死細胞明亮，所以暗視野也被用來(lái)區分死、活細胞，此技術(shù)現已被用于各種酵母細胞的死、活鑒別。此外，暗視野顯微鏡對于觀(guān)察嬌弱的微生物，如梅毒密螺旋體（Treponema pallidum）特別有用。
二、器材
　　釀酒酵母（Saccharomy-ces cerevisiae）；
　　暗視野顯微鏡，載玻片，蓋玻片，無(wú)菌水。
　　四、操作步驟
1．選厚薄在1．0—1．2mm的干凈載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片（注意切勿有氣泡存在）。
2．將聚光鏡光圈調至1．4。
3．光源的光圈孔調至最大。
4．在聚光器上放一大滴香柏油，將標本置載物臺上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不能有氣泡發(fā)生）。
5．用低倍物鏡及7×目鏡進(jìn)行配光對準物體。調節聚光器的高度，首先在載玻片上出現一個(gè)中間有一黑點(diǎn)的光圈，最后為一光亮的光點(diǎn)（圖Ⅲ-7），光點(diǎn)愈小愈好，由此點(diǎn)將聚光器上下移動(dòng)時(shí)均使光點(diǎn)增大。
6．換上所需目鏡和高倍鏡，緩慢上升物鏡進(jìn)行調焦，至視野中心出現發(fā)光的樣品。
7．在蓋玻片上滴一滴香柏油，并將油鏡轉至應在位置調節配光，進(jìn)行觀(guān)察。
四、注意事項
　　1．進(jìn)行暗視野觀(guān)察時(shí)，聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿(mǎn)，否則照明光線(xiàn)于聚光鏡上面進(jìn)行全面反射，達不到被檢物體，從而不能得到暗視野照明。
　　2．在進(jìn)行暗視野觀(guān)察標本前，一定要進(jìn)行聚光鏡的中心調節和調焦，使焦點(diǎn)與被檢物體一致。
　　3．由于暗視野聚光鏡的數值孔徑都較大（ NA=1．2—1．4），焦點(diǎn)較淺，因此，過(guò)厚被檢物體無(wú)法調在聚光鏡焦點(diǎn)處，一般載玻片厚度為1．0mm左右，蓋玻片厚度宜在0．16mm以下，同時(shí)載玻片、蓋玻片應很清潔，無(wú)油脂及劃痕，否則都會(huì )嚴重地擾亂最終的像。
五、實(shí)驗報告

 

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