進(jìn)出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法——2

6.1 樣品的存放與制備如為冷凍樣品應于2℃~5℃解凍，且不超于18h，若不能及時(shí)檢驗，應置于-15℃保存，非冷凍的易腐樣品應盡可能及時(shí)檢驗，若不能及時(shí)檢驗，應置于4℃冰箱保存，在24h之內檢驗。
無(wú)菌取樣品25g（ml）放入滅菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中加225mLPBZE增菌液中，充分均質(zhì)。
6.2 增菌培養
FB1增菌液225ML放30℃±1℃培養25h±1h吸收1ml加入10mlFB2增菌液中放30℃±1℃二次增菌25h±1h.
6.3 VIDA8快速篩選
取FB2增菌液，可按儀器生產(chǎn)廠(chǎng)的說(shuō)明采取VIDA8快速篩選法進(jìn)行快速篩選檢測，75min可獲初步結果。對于篩選為陰性的結果可直接按8.2報告來(lái)檢出單核細胞李斯特氏菌。對于篩選為陽(yáng)性的結果按照6.4和6.9的條款進(jìn)行分離培養和鑒定。
6.4 分離培養
6.4.1 選擇性培養基的分離培養
取增菌液一杯，劃線(xiàn)分離于選擇性培養基OXA、PALCAM瓊脂平板上30℃±1℃培養24h~48h
6.4.2黑色菌落觀(guān)察
李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長(cháng)24h后菌落呈現黑色，直徑為4mm，在其周?chē)�形成一個(gè)黑色環(huán)，培養48h，菌落仍呈黑色，直徑2mm~3mm，除在菌落周?chē)�有一環(huán)外，在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在OXA瓊脂平板上的菌落相似。
在OXA瓊脂平板和PALCAM瓊脂平板上挑選5個(gè)或更多可疑菌落，接種于TSA-YE瓊脂平板上，純培養后進(jìn)行鑒定。
6.5 鑒定
6.5.1 藍色菌落鑒定
用45°斜射光照射TSA-YE瓊脂平板，菌落呈現藍灰色到藍色，用標準菌株作為陽(yáng)性對照，將純化后的菌落接種于TSB-YE肉湯，30℃培養24h，供生化等項目檢驗使用。
6.5.2 類(lèi)型運動(dòng)鏡檢
挑選在TSA-YE瓊脂平板上生長(cháng)良好的菌落于潔凈載玻片上，用0.8%生理鹽水制成懸浮液，壓上蓋玻片，于顯微鏡下觀(guān)察，李斯特氏菌為短棒狀桿菌，可見(jiàn)輕微的旋轉翻滾。用標準菌株作為對照。
6.5.3 革蘭氏染色
按照GB/T4789，38-2003進(jìn)行革蘭氏染色李斯特氏菌顯短桿狀革蘭氏陽(yáng)性反應。
6.5.4 過(guò)氧化氨酶實(shí)驗
挑取TSA-YE平板上的菌落于潔凈載玻片上，滴加1滴3%過(guò)氧化氫（H2O2）溶液，李斯特氏菌呈過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應。
6.5.5 溶血實(shí)驗
將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)~25個(gè)小格，每格刺種一個(gè)菌落，從每個(gè)TSA-YE瓊脂平板上至少挑取2個(gè)菌落刺種血平板，并刺種陽(yáng)性對照菌（單核細胞增生李斯特氏菌利綿羊李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），30℃培養24h~48h，穿刺應剛剛透過(guò)瓊脂層，盡量避免接觸平板底部時(shí)太猛烈和和使瓊脂破裂，于明亮處進(jìn)行觀(guān)察，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)�產(chǎn)生窄小的透明β型溶血環(huán)，綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生大的β型溶血環(huán)，其他李斯特氏菌種不產(chǎn)生溶血環(huán)，
6.5.6動(dòng)力試驗
將TSB-YE肉湯培養物穿刺接種于SIM半固體培養基，于室溫（20℃～25℃）培養48h,李斯特氏菌有動(dòng)力，在半固體試管內呈典型傘狀生長(cháng)。
6.5.7硝酸鹽還原試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種與硝酸鹽肉湯中，于35℃培養5d,加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑B,輕搖混合，如在1min～2min內出現紅色，判斷為陽(yáng)性反應，如果沒(méi)有顏色顯現，在含有試劑A和試劑B的試管內再加入少量鋅粉，（約20mg）放置1h,如出現紅色，表示仍有硝酸鹽存在，未被細菌還原，判斷為陰性。
6.5.8 MR-VP試驗
將TSB-YE肉湯培養物接種與MR-VP肉湯中，于35℃培養48h，移取1ml培養物于潔凈試管中，加5%α-萘酚溶液0.3ml，在加4%氫氧化鉀溶液0.2ml，輕輕搖動(dòng)試管約1min，靜置約20min，出現紅色為VP陽(yáng)性反應，將剩余培養液繼續與35℃培養48h，加甲基紅指示劑1滴于試管中，出現紅色為MR陽(yáng)性反應，李斯特氏菌均為MR-VP陽(yáng)性反應。
6.5.9 三糖鐵試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種于三糖鐵瓊脂（TSI）,于35℃培養5d，李斯特氏菌在斜面和底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)硫化氫   
   

 

上一篇：進(jìn)出口行業(yè)標準-出口食品沙門(mén)氏菌屬(包括亞利桑那菌)——7

下一篇：進(jìn)出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測方法——3