我國行業(yè)標準-出口食品中霍亂弧菌檢驗方法——1,1

   7.1 自分離培養基上挑取可疑菌落與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。如可疑菌落在診斷血清中很快（一般在10s內）出現肉眼可見(jiàn)的明顯凝集，在生理鹽水中不凝集者判斷為陽(yáng)性。
7.2 O1群多價(jià)血清陽(yáng)性的霍亂弧菌可進(jìn)一步用小川型、稻葉型的單價(jià)抗血清分型。
7.2..1 在小川型單價(jià)血清凝集，在稻葉型單價(jià)血清不凝集者為小川型。
7.2.2在小川型單價(jià)血清凝集，在稻葉型單價(jià)血清不凝集者為小川型。
7.2.3在小川型、稻葉型單價(jià)血清均呈明顯凝集者為彥島型。
7.3 與O1群或O139群霍亂弧菌診斷血清及生理鹽水均不凝集者為非O1群霍亂弧菌。
7.4 與O1群霍亂弧菌多價(jià)血清或O139群霍亂弧菌診斷血清及生理鹽水均凝集的，可用胰胨水大豆瓊脂或腦心浸液瓊脂傳代，再進(jìn)行凝集試驗。
7.5 對玻片凝集反應不典型的菌株應做試管凝集試驗。
   用生理鹽水自1：20開(kāi)始對倍連續稀釋O1群霍亂弧菌多價(jià)血清，每管含稀釋血清0.5mL。將被檢菌在營(yíng)養瓊脂的16h～18h培養物用0.2％甲醛生理鹽水制成每毫升約含18億菌體（相當于細菌標準比濁管濃度）的懸液，每稀釋血清管加入0.5mL；另將菌懸液0.5mL加入0.5mL生理鹽水中作為對照。搖勻，置37℃3h觀(guān)察初步結果。再放4℃或室溫過(guò)夜，觀(guān)察最后結果：生理鹽水對照不出現自然凝集，能使菌凝于管底成傘狀，上清半透明判為＋＋；能使試驗菌出現＋－凝集的血清最高稀釋倍數為凝集滴度。凝集滴度達到或超過(guò)血清原效價(jià)一半即確定為O1群霍亂弧菌。
8、古典型與埃爾托型霍亂弧菌的鑒別
8.1 多粘菌素B敏感試驗
8.1.1在胰酪胨大豆胨瓊脂平板背面用玻璃筆劃出若干方格。
8.1.2將被檢菌（36±1）℃4h肉湯培養物劃線(xiàn)平板表面，待干后鑷取50單位多粘菌素B紙片置于接種區中央，倒置平板，（36±1）℃培養過(guò)夜。
    古典型菌株在紙片周?chē)�呈現抑制帶（10mm～15mm直徑），而埃爾托型菌株不受抑制或輕微抑制（7mm直徑）。
8.2溶血試驗
8.2.1將24h培養物和5％紅細胞鹽水懸浮液等量混合（0.5mL或1mL）。
8.2.2將上項部分混合液在56℃加熱30min做對照。
8.2.3將混合物在（36±1）℃水溶液中培養2h，再在（4～5）℃下冷藏過(guò)夜。
8.2.4檢查溶血現象，必要時(shí)可低速離心后再檢查有無(wú)溶血現象。
     多數埃爾托型菌株會(huì )造成紅血球溶解，古典型及某些埃爾托型菌株不溶解紅血球，由于溶血素不耐熱，加過(guò)熱的培養物不會(huì )產(chǎn)生溶血。
8.3加試劑觀(guān)察結果。
   埃爾托型V-P試驗
8.3.1接種MR-VP肉湯，22℃培養18h～24h。
8.3.2滴菌株通常為陽(yáng)性，古典型菌株通常為陰性。
9、報告結果
霍亂弧菌的檢出，可依據以下性狀報告：
革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢或彎曲桿菌；
TSI：斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫（H2S）；
Hugh-Leifson試驗：葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性；
氧化酶：陽(yáng)性；
精氨酸脫羧酶試驗：陰性；
賴(lài)氨酸脫羧酶試驗：陽(yáng)性；
V-P試驗：埃爾托生物型陽(yáng)性，古典生物型陰性；
42℃生長(cháng)：陽(yáng)性；
嗜鹽性試驗：0％NaCl＋（有的非O1群霍亂弧菌不生長(cháng)）
  3％NaCl＋
  6％NaCl－
  蔗糖發(fā)酵：陽(yáng)性；
  ONPG試驗：陽(yáng)性；
  阿拉伯糖發(fā)酵：陰性；
  O129抑菌試驗：10μg敏感；150μg敏感；
血清學(xué)試驗：O1群（稻葉型、小川型、彥島型）、O139群、非O1群。
最終結果的報告，應在生化試驗的基礎上報告血清型別和生物型別。
如有明確規定，僅需檢驗O1、O139群霍亂弧菌時(shí)，可直接對可疑菌株進(jìn)行血清學(xué)凝集試驗進(jìn)行初步鑒定。
檢出O1、O139及非O1群霍亂弧菌的，要在24h內呈報到上一級實(shí)驗室做進(jìn)一步鑒定或復查，并報告國家出入境檢驗檢疫局。   
   
   

 

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