乳酸桿菌分離鑒定技術(shù)研究進(jìn)展——2

2 乳酸桿菌的鑒定 
2.1 屬水平的鑒定 
   乳酸桿菌屬水平的鑒定是乳酸桿菌整體鑒定過(guò)程中較為簡(jiǎn)單且最為基本的步驟。常用的方法是對分純后的乳酸桿菌培養物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，選擇無(wú)分叉的G桿菌。如果這些無(wú)分叉G桿菌經(jīng)過(guò)培養后，在p H 4.5的條件下能夠生長(cháng)并且過(guò)氧化氫試驗、硝酸鹽還原驗、 聯(lián)苯胺反應、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗均為陰性即可鑒定其為乳酸桿菌屬。  
2.2 種水平的鑒定 
2.2.1 生化鑒定  乳酸桿菌種水平的生化試驗主要采用糖醇類(lèi)發(fā)酵試驗。不同乳酸桿菌對糖的利用情況不一，以此可作為種水平鑒定的依據。傳統的生化鑒定方法是配制各種特異性生化反應管，該方法雖然成本較低。但費時(shí)費力，不適于大批量樣品的快速鑒定，并且反應管種類(lèi)較少所以結果的判定受限制。近年來(lái)， 法國梅里埃公司研發(fā)的API S OCH／CHL鑒定 系統試驗卡是由4 9種可發(fā)酵碳水化合物組成的簡(jiǎn)易培養基， 接種菌后反應48h即可直讀 結果。由于乳酸桿菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸導致p H值下降使指示劑變色，所以結果極易判別。AP I 50CH／ CHL鑒定系統是目前國內外應用最廣泛、結果準確可靠的快速生化鑒定系統。缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，不適于大規模菌種的鑒定。  
2.2.2 基因鑒定 
2.2.2.1 P C R．隨機擴增多態(tài)性DNA (PCR．randomly amplified polymorphic DN A，PCR．RAPD) RAP技術(shù)是在2O世紀8 O年代末90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的、 能夠全面系統地探索基因組功能的強有力高新技術(shù)工具，通過(guò)對PCR產(chǎn)物的分析檢測， 以獲得基因組DN在待測區域內的多態(tài)性進(jìn)行鑒別，目前RAPD．PCR技術(shù)已成為乳酸桿菌鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢。2006年RANTSIO等利用RAPD技術(shù)對從發(fā)酵肉制品中分離出的三種乳酸桿菌進(jìn)行了分類(lèi)，成功的將 69株彎曲乳酸桿菌歸為7類(lèi)， 69株植物乳酸桿菌歸為lO類(lèi)， 173株清酒乳酸桿菌歸為23類(lèi)。有報道指出，若將 RAPD技術(shù)與生化反應結果相結合可更準確地鑒定乳酸桿菌。R APD具有快速、簡(jiǎn)便、成本相對較低、特異性強等特點(diǎn)，尤其對于鑒別親緣關(guān)系較近的細菌更為有效，缺點(diǎn)是需要相關(guān)的標準菌株做參比。  
2.2.2.2 限制性片段長(cháng)度多態(tài)性PCR( PCR ． restriction  f ragment  length  polymorphism， PCR - Rna) RFL是一種全基因組方法，它作為第一代分子生物學(xué)方法在過(guò)去的幾年被廣泛應用于微生物的鑒定，目前，也被廣泛應用于乳酸桿菌的分類(lèi)及鑒定。 已發(fā)表文獻中包括針對乳酸桿菌內特定基因進(jìn)行特異擴增的PC方法， 如針對t u f(encoding for  elongation factor   Tu) 基因PC方法可以將包括德氏乳酸桿菌德氏亞種、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種、德氏乳 酸桿菌嗜酸亞種、嗜酸乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、 發(fā)酵乳酸桿菌等15種乳酸桿菌進(jìn)行鑒別]。針對mal( malolactic  enzyme ) 基因的PCR法可以將包括唾液乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、 乳酸乳酸桿菌、 短乳酸桿菌等9種乳酸桿菌鑒別開(kāi)來(lái)。前不久BLAIOTTA等針對乳酸桿菌的hsp6 0(heat-shock protein)基因進(jìn)行特異性PCR．RF LP擴增，結果對包括干酪乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、 植物乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、 彎曲乳酸桿菌、 瑞士乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌等43種乳酸桿菌進(jìn)行明確的鑒定。RFLP的主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、快速，終點(diǎn)判斷準確，缺點(diǎn)是酶的選擇困難。通常情況下， 這種方法需要兩種或兩種以上的酶相結合方可對諸多菌種進(jìn)行鑒別，所以在酶的選擇上需要較高的專(zhuān)業(yè)知識水平，并且部分酶價(jià)格昂貴，因此實(shí)驗成本較高。     
   

 

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