出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌檢驗方法——2

5 樣品處理
5.1 鬃、毛、絨、生骨粒
5.1.1 根據樣品多少將適當數量的同批樣品(最多不超過(guò) 10份)合編為一個(gè)檢驗樣品單位,作好記錄。
5.1.2 從合編為一個(gè)檢驗樣品單位的每個(gè)樣品袋中各取 1～2g樣品,一起放入一個(gè)適當大小的滅菌三角燒瓶中。
5.1.3 加樣品量 30～40倍(W/V)的預冷洗樣液于三角燒瓶,用滅菌膠塞將瓶口塞嚴。
5.1.4 將三角燒瓶放入冰水浴或 0～4℃冰箱內,間或搖動(dòng)約 1h。
5.1.5 將瓶中洗樣液倒入 500mL滅菌離心管內,蓋住管口,以3000r/min離心20min。
5.1.6 棄去上清液(注意防止污染),加少許滅菌水,使沉淀均勻懸浮。
5.1.7 將離心管靜置 5～10min,待雜質(zhì)下沉后,將上懸液移入另一支滅菌試管內,于65℃恒溫水浴加熱 30 min。
5.1.8 加洗樣液后的樣品于熱處理前如不能及時(shí)檢驗,應貯于0～4℃冰箱內,以防芽胞發(fā)芽。
5.2 動(dòng)物毛皮如不立即檢驗,將棉拭子放于0～4℃冰箱內。
6 檢驗方法
6.1 分離培養
6.1.1 鬃、毛、絨、生骨粒
6.1.1.1 根據每管所包括樣品份數之多少,各接種 1～3個(gè)溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接種時(shí),用滅菌吸管吸取樣液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有剩余樣品,可增接數個(gè)平板,直至將樣品接種完。
6.1.1.2 用滅菌 L形玻璃棒將滴加的樣液涂布均勻。如樣液較多,可將平板置于36±1℃溫箱,微開(kāi)皿蓋,使樣液迅速干燥。
6.1.1.3 翻轉平皿,置于36±1℃恒溫箱,培養 24～48h。
6.1.2 動(dòng)物毛皮
6.1.2.1 將棉拭子由試管內取出,各涂抹一個(gè)溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。6.1.2.2 翻轉平皿,置于36± 1℃恒溫箱,培養 24～48 h。
6.2 菌落及菌形觀(guān)察
6.2.1 將培養的平板取出,用肉眼,必要時(shí)借助放大鏡觀(guān)察有無(wú)典型炭疽桿菌菌落。炭疽桿菌菌落扁平、暗灰色、不透明、無(wú)光澤、表面粗糙、邊緣不整齊。用放大鏡觀(guān)察,邊緣呈卷發(fā)狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。
6.2.2 從典型或可疑菌落取培養物制備涂膜,經(jīng)革蘭氏染色,鏡檢。炭疽桿菌被染成藍紫色,由多個(gè)菌縱連成長(cháng)鏈。少數單個(gè)菌呈大桿狀,兩端平齊。有的菌體中央可見(jiàn)卵圓形不著(zhù)色的芽胞。芽胞不使菌體膨大。
6.3 肉湯培養特性觀(guān)察取菌落和菌形均似炭疽桿菌的培養物,接種肉湯管,于 36±1℃恒溫箱培養 5～12h,觀(guān)察細菌生長(cháng)情況。炭疽桿菌在肉湯中生長(cháng)初期的特征是：肉湯上部澄清,無(wú)菌膜,下部有絮狀沉淀,沉淀不易搖散。
6.4 確定試驗
6.4.1 大豆凝集素吸收試驗
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀釋液(A11)一滴于比色板或載玻片上。
b. 用接種環(huán)取一滿(mǎn)環(huán)可疑菌落,研混于大豆凝集素稀釋液內成濃厚菌液,持續攪拌2～3min。
c. 加一滴 5％兔血球懸液,攪勻,前后傾動(dòng)玻片 3～5min,觀(guān)察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
＋＋＋＋：血球凝集成塊狀,均勻散布,液體無(wú)色。
＋＋＋：血球凝集成大顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
＋＋：血球凝集成顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
＋：血球凝集成細小顆粒,均勻散布,液體無(wú)色。
±：血球凝集成細微顆粒,均勻散布,液體呈不顯著(zhù)黃紅色。
－：血球不凝集,搖動(dòng)后匯集于中央,呈淡黃紅色,液體呈不顯著(zhù)黃紅色。
注：“＋＋＋”～“＋”為陽(yáng)性�！啊馈睘榭梢��！埃�”為陰性。
6.4.2 噬菌體裂解試驗
6.4.2.1 方法
a. 用營(yíng)養瓊脂平板的皿底外面畫(huà)三個(gè)直徑約 30mm ,相隔約 20mm為圓圈。
b. 用接種環(huán)取可疑炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物涂滿(mǎn)與兩個(gè)圓圈相對應的瓊脂表面。另取已知炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物,涂滿(mǎn)與第三個(gè)圓圈相對應的瓊脂表面,作上區分的標記。
c. 待菌液被吸干后,在接種被檢菌的圓圈內,一個(gè)加一滴無(wú)菌肉湯,另一個(gè)加一滴炭疽桿菌噬菌體。在接種已知炭疽桿菌的圓圈內,加一滴炭疽桿菌噬菌體。
d. 將平皿放入36±1℃ 恒溫箱(隔架面要平,以防噬菌體液流散),微開(kāi)皿蓋,使液體迅速干燥。然后翻轉平皿,培養12～18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌體的兩個(gè)圓圈內都出現蝕斑,加肉湯的圓圈內無(wú)蝕斑,為陽(yáng)性反應。
b. 加已知炭疽桿菌的圓圈內出現蝕斑,加被檢菌的兩個(gè)圓圈內無(wú)蝕斑,為陰性反應。
c. 三個(gè)圓圈內都無(wú)蝕斑,表明噬菌體已失效,應另?yè)Q有效噬菌體進(jìn)行試驗。
6.4.3 串珠試驗
6.4.3.1 方法
a. 取適量 4～12h可疑炭疽桿菌肉湯培養物,接種于 1.8mL肉湯管內(制備濕片在低倍顯微鏡下檢查,每個(gè)視野應含菌鏈 5～10條)。
b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最終濃度為 0.5IU/mL 。
C. 于 37℃水浴培養 1～2h ,取出,加入 20％ 福爾馬林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 制備濕片,在顯微鏡下檢查。
6.4.3. 判定
＋＋＋＋：菌體大而圓,均勻,排列整齊；
＋＋＋：菌體圓,均勻,排列整齊；
＋＋：菌體橢圓,排列整齊；
＋：菌體均勻腫大,變粗；
±：菌體大小不一,不圓,排列不整齊；
－：菌體形態(tài)無(wú)變化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”為陽(yáng)性�！啊馈睘榭梢��！埃�”為陰性。6.4.4 動(dòng)物試驗6.4.4.1 取可疑炭疽桿菌的肉湯培養物,用生理鹽水稀釋為 10 000個(gè)菌/mL(微混濁),接種 2～3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL；其余每只于腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1～3d內),立即進(jìn)行剖檢,觀(guān)察有無(wú)炭疽病理變化(如皮下膠樣水腫,脾臟腫大,血凝不良),制備數張血液和腹水涂片,供做菌形檢查,同時(shí)取病變材料或體液接種數管肉湯,以備核查。
6.4.5 染色鏡檢
6.4.5.1 染色液的配制
A液：美藍 0.3g乙醇(95％) 30.0mL
B液：0.01％氫氧化鉀溶液 100mL將 A、B兩液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 將被檢材料的涂片浸入固定液內 15～20 min；
b. 滴加染色液浸沒(méi)涂膜,染色 1～2 min；
c. 用水沖去染色液,自然干燥或用吸墨紙吸干水分；
d. 鏡檢。
6.4.5.3 判定炭疽菌菌體呈藍色,粗大桿狀,兩端平齊,相連成短鏈或成對,菌體周?chē)�以淡藍紫色莢膜。   
   

 

上一篇：中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標準SN 0331—94 出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌檢驗方法

下一篇：出口畜產(chǎn)品中炭疽桿菌檢驗方法——3