中華人民共和國國家標準 食品衛生微生物學(xué)檢驗沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸——2

檢驗步驟
6.1前增菌、增菌和分離6.1.1沙門(mén)氏菌的前增菌、增菌和分離，按GB/T4789.4進(jìn)行。6.1.2志賀氏菌的增菌和分離，按GB/T4789.5進(jìn)行。6.1.3致瀉大腸埃希氏菌的增菌和分離，按GB/T4789.6進(jìn)行。6.2噬菌體試驗6.2.1培養基準備營(yíng)養瓊脂平板（含瓊脂1%——1.5%，瓊脂量視其凝固性而定，約為一般用量的四分之三），每個(gè)90mm培養皿中約25ml，放在水平臺面上挨其凝固，翻轉平板，在36℃半開(kāi)皿倒置約lh，以烘干培養基表面水分，并便瓊脂具有顯著(zhù)的吸水性6.2.2試驗菌液的準備從選擇性鑒別平板上挑取菌落，一般應多挑幾個(gè)菌落，以防遺漏。檢驗沙門(mén)氏菌時(shí)，不俱應挑取乳糖陰性產(chǎn)H2S和不產(chǎn)H2S的菌落，還應挑取乳糖陽(yáng)性產(chǎn)H2S的菌落。檢驗大腸埃希氏菌時(shí)應挑取乳糖陽(yáng)性或陰性的菌落3個(gè)～5個(gè)。檢驗志賀氏菌時(shí)應挑取可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體管，于36℃培養過(guò)夜，次日選取三糖鐵底層產(chǎn)酸、斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)H2S．不產(chǎn)氣無(wú)動(dòng)力的培養物。下述兩種方法可供選用．6.2.2.1一法：將待試菌落接種于營(yíng)養肉湯管內，于36℃培養過(guò)夜。挑取此肉湯培養物一滿(mǎn)環(huán)，稀釋于盛有1mL——2mL蛋白陳水的試管內，使成為（1：200）一（1：400）稀釋菌液，含菌量約為l*l0（6）/mL。
6.2.2.2二法：用接種針在鑒別平板上輕輕蘸取可疑菌落，挑取菌量不宜過(guò)多，稀釋于盛有1ml——2mL蛋白陳水的試管內，使其含菌量約與一法相似。6.2.3涂抹試驗菌液6.2.3.1斑點(diǎn)涂抹法：將營(yíng)養瓊脂平板表面自圓心起分為三等份．每等份可供涂抹一株細菌培養物，每挑取試驗菌液一滿(mǎn)環(huán)，徐抹直徑約1cm的菌斑一個(gè)。每株培養物涂抹七個(gè)菌斑，外圈四個(gè)，內圈三個(gè)。6.2.3.2棉簽涂抹法：用無(wú)菌棉簽蘸取試驗菌液并略擠去過(guò)多液體，在如上瓊脂平板表面三分之一的區域內涂抹。三個(gè)涂抹區之間保持適當距離。略等數分鐘，待菌液干燥。6.2.4滴加噬菌體  用定量乳頭滴管在一個(gè)菌斑上滴加噬菌體一滴，依次為分O-I、C、Sh、E、CE、E4和Ent。滴管上安裝4號針頭，每毫升約為100滴。每支滴管只滴加一種噬菌體，針尖絕對不能接觸平板表面，嚴格防止交叉污染。每用一支滴管，可把全部待試菌應滴加噬菌體的菌斑部位全部滴加完畢。滴加噬菌體時(shí)必須將瓊脂平板放在水平臺面土。7種噬菌體滴加完畢后，略等數分鐘，待噬菌體液干燥。翻轉平板，放36℃ 培養5h一6h，并過(guò)夜各觀(guān)察一次結果。  如果僅有一兩株培養物作噬菌體試驗，則可用直徑為3mm的接種環(huán)挑取噬菌體，依次滴加在菌斑上。灼熱的接種環(huán)必須究全冷卻以后方可挑取噬菌體。6.2.5試驗結果的判定   按表1判定噬菌體試驗的結果。必要時(shí)吸取少許剩余的蛋白脈水培養物作靛基質(zhì)試驗，大腸埃希氏菌培養物一般為靛基質(zhì)陽(yáng)性。
6.2.6供快速檢驗沙門(mén)氏菌的噬菌體簡(jiǎn)化診斷法
采用如下三種噬菌體：
a）沙門(mén)氏菌C-I噬菌體
b）E多價(jià)噬菌體，包括E和SH
C）C多價(jià)噬菌體，包括C、CE、Ent
6 . 3噬菌體不裂解培養物的補充生化試驗
有少數的沙門(mén)氏菌培養物不被住工噬菌體裂解，并有少數的大腸埃希氏菌培養物不被相應噬菌體
 
培養基和試驗菌液的準備同前法。 
  涂抹試驗菌液：斑點(diǎn)涂抹法將瓊脂平板表面分為四等份，每等份可供涂抹一株細菌培養物。每株培養物涂抹三個(gè)菌斑，外圈兩個(gè)，內圈一個(gè)。棉簽涂抹法可將試驗菌液在瓊脂平板上涂抹成帶狀，每個(gè)平板約可涂抹五條菌帶。略等數分鐘，帶菌斑干燥。
  依次滴加上述三種噬菌體，在36℃培養5—6h和過(guò)夜，各觀(guān)察一次結果。按表2判定簡(jiǎn)化診斷法的結果。
表2   三滴法噬菌體試驗簡(jiǎn)化診斷表
O-I   E多價(jià)  C多價(jià)   判定結果
CL      -      -      沙門(mén)氏菌屬
*       CL     *       大腸埃希氏菌
-       -     CL       弗勞地氏檸檬酸桿菌a
-       -     -        噬菌體陰性培養物
注：CL 融合性裂解  ；- 不裂解 ；* 裂解或不裂解 ；a 包括陰溝腸桿菌和少數大腸埃希氏菌。
6.3噬菌體不裂解培養物的補充生化試驗
   有少數的沙門(mén)氏菌培養物不被O-I噬菌體裂解，并有少數的大腸埃希氏菌培養物不被相應噬菌體裂解，故應將不被各種噬菌體裂解的培養物接種三糖鐵瓊脂，以下分別按GB/T4789.4和GB/T4789.6進(jìn)行。6.4血清學(xué)分型鑒定6.4.1沙門(mén)氏菌按GB/T4789.4進(jìn)行。6.4.2致瀉大腸埃希氏菌按GB/T4789.6進(jìn)行．6.4.3志賀氏菌6.4.3.1記錄噬菌體試驗的結果，并按表3判定血清學(xué)分型鑒定的方向。Sh噬菌體不裂解的培養物不屬于志賀氏菌。已知全部志賀氏菌培養物均能被Sh噬菌體裂解，且將其稀釋至1 RTD時(shí)，有的寫(xiě)的志賀氏菌培養物仍應被裂解。表3噬菌體試驗的結果和志賀氏菌血清學(xué)分型鑒定的方向   
   

 

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