軍團菌的鑒定

 軍團菌屬是一種具有高度暴發(fā)流行性呼吸道疾病的病原菌，為革蘭陰性胞內寄生菌。 
【材料】 
1、菌種嗜肺軍團菌4—10天的培養物。 
2、培養液BCYE平板（酵母浸膏、半胱氨酸、硝酸鐵培養液 ），F-G平板（費-高改良M-H培養液），血平板，巧克力色血平板及各種生化反應培養液。 
3、試劑相應生化反應檢測試劑。 
4、診斷菌液軍團菌標準株可溶性抗原、軍團菌致敏紅細胞。 
5、其他：革蘭染液、鞭毛染液、姬美尼茲染液、蘇丹黑染液等。 
【方法】 
1、鑒定程序： 
2、形態(tài)觀(guān)察革蘭染色：幼齡菌為革蘭陰性短小桿菌，培養數日后可見(jiàn)多形性和長(cháng)絲狀。革蘭染色還可見(jiàn)菌體有空泡。鞭毛染色可見(jiàn)1—2根單鞭毛和側鞭毛，無(wú)莢膜、無(wú)芽胞。 
3、培養特性觀(guān)察：將待檢菌接種BCYE平板、F-G平板、血平板和巧克力（色）血平板上，須置37℃，2.5%二氧化碳，需氧高濕度環(huán)境下培養37天。如果在48小時(shí)內出現菌落或在這些培養液上均生長(cháng)，則不是軍團菌，如果僅在BCYE或F-G平板上生長(cháng)，另外兩種平板上不生長(cháng)，而且至少在72小時(shí)以后出現菌落，則可能是軍團菌。在BCYE平板上4—5天可形成針尖大小的菌落，繼續培養數日后菌落直徑可增大至4—5mm。菌落灰白色、圓形、濕潤、有光澤、邊緣透明。呈刻花玻璃樣條紋為其特征。菌落較為黏著(zhù)，并有特有的酸臭味。在紫外線(xiàn)可見(jiàn)表面呈現白色自發(fā)熒光。在F-G平板上培養10天才見(jiàn)生長(cháng)，并可產(chǎn)生棕色色素。 
4、生化反應觸酶、氧化酶、β-內酰胺酶及馬尿酸水解實(shí)驗均陽(yáng)性，不分解糖類(lèi)產(chǎn)酸、脲酶及硝酸鹽還原實(shí)驗陰性。 
5、氣相色譜顯示軍團菌的細胞脂肪酸組成，易與其他細菌區別。 
6、血清學(xué)檢查 
（1）微量凝集實(shí)驗：首先將軍團菌標準株接種于BCYE或其他專(zhuān)用培養液上，35℃2.5%二氧化碳，需氧高濕度環(huán)境下培養3—4天，用0.01mol/l、pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔，沸水浴1小時(shí)殺菌。2000rpm離心10分鐘后棄去上清液。用含0.5%福爾馬林的磷酸鹽緩沖液配成懸液，使其濃度在420nm波長(cháng)，光徑1cm時(shí)吸光度值為0.65，即為診斷菌液。診斷菌液在用前加石炭酸復紅液1ul。 
   在微量血凝反應板上，將待測患者血清用0.01mol/l、pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）作2倍連續稀釋?zhuān)�每�?5ul，然后各孔加入診斷菌液25ul，混勻1分鐘，置濕盒室溫過(guò)夜。 
   目視判定結果，以50%（+ +）凝集為終點(diǎn)，引起50%凝集的血清最高稀釋度的倒數為其滴度。 
（2）間接血凝實(shí)驗：將軍團菌標準株接種于BCYE或其他專(zhuān)用培養液上，35℃2.5%CO2需氧高濕度環(huán)境下培養3—4天，用0.01mol/l、pH7.4洗下菌苔，沸水浴1小時(shí)殺菌。4℃冷浸7—10天，2000rpm離心15分鐘，上清液即為可溶性抗原，加疊氮鈉至1.0g/l，4℃保存。 
    取甲醛、丙酮醛雙醛醛化綿羊紅細胞0.1ml，加最適稀釋度可溶性抗原（以預實(shí)驗選取出現特異性凝集的最高稀釋度），用0.01mol/l、pH7.4稀釋至1ml，37℃水浴1小時(shí)致敏，用PBS洗3次，以含1.0g/l明膠、0.4g/l牛血清清蛋白、0.5%羊紅細胞膜的0.01mol/l、pH7.4的PBS配成0.75懸液，即為致敏紅細胞。 
    在微量血凝反應板上，將待測患者血清用PBS作2倍連續稀釋?zhuān)�每�?5ul，各孔補加PBS25ul，將微量反應板置振蕩器上，邊振蕩邊加人致敏紅細胞（每孔滴加25ul），混勻1分鐘，置濕盒內于室溫2小時(shí)后判定結果。 
    目視判定結果，以50%（+ +）凝集為終點(diǎn)。出現50%凝集的血清最高稀釋度的倒數為效價(jià)。 
（3）直接熒光抗體染色：涂片干燥后，滴加FTTC標記的抗軍團菌多價(jià)或相應單價(jià)抗體染色，熒光顯微鏡下可見(jiàn)有強烈黃綠色熒光的細菌。   
   

 

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