金黃色葡萄球菌腸毒素與多器官功能障礙綜合征
姚詠明，盛志勇
(解放軍第三○四醫院燒傷研究所,北京100037)
臨床資料表明,革蘭陽(yáng)性(G＋)菌膿毒癥的發(fā)病率逐年上升，至20世紀90年代已達膿毒癥發(fā)病率的40％以上，并仍有升高趨勢。其中金黃色葡萄球菌(金葡菌)發(fā)病率位居首位，是燒傷創(chuàng )面感染、急性肝衰竭的重要病原菌。由于其致病因素復雜、耐藥性不斷增強，特別是中間型抗萬(wàn)古霉素金葡菌的出現，金葡菌感染所致膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的防治已成為現代創(chuàng )傷外科和危重病醫學(xué)面臨的棘手難題之一。我們回顧性調查了近5年間從創(chuàng )面分離的病原菌1 661株，其中金葡菌分離率從1995年的17.7%(居第3位)上升為1999年的29.3%(居第1位)；此外，278例次靜脈內置管的嚴重燒傷患者，7例次發(fā)生導管膿毒癥(5例死亡)，其分離病原菌中金葡菌占50%以上。由此可見(jiàn)，金葡菌是燒傷感染中最常見(jiàn)的菌種之一，其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的耐藥性強，易引起膿毒癥和MODS等致死性并發(fā)癥。細菌學(xué)研究表明，可溶性外毒素的產(chǎn)生是G＋菌感染的重要標志之一，在G＋菌感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。其中金葡菌腸毒素因其"超抗原"(superantigen)特性以及在中毒性休克綜合征、MODS發(fā)病中的特殊意義而倍受關(guān)注。
流行病學(xué)調查顯示，從我院燒傷患者及醫務(wù)人員手和鼻腔中分離出的127株金葡菌中，產(chǎn)毒率高達91.6%，而且以同時(shí)產(chǎn)生多種類(lèi)型毒素者居多〔同時(shí)產(chǎn)腸毒素B、C (SEB、SEC)者最為常見(jiàn)〕，其中90%以上為耐藥菌株。北京積水潭醫院檢測100株金葡菌腸毒素產(chǎn)生情況，結果表明總產(chǎn)毒率為68%，其中60株MRSA全部產(chǎn)一種或一種以上腸毒素，而40株非MRSA產(chǎn)毒率僅為20%。上述結果初步提示，產(chǎn)腸毒素金葡菌普遍存在于燒傷患者的創(chuàng )面、呼吸道，且MRSA較非MRSA有更強的毒力和致病性，對燒傷后并發(fā)金葡菌感染構成潛在的威脅。但迄今為止，關(guān)于金葡菌腸毒素在燒傷膿毒癥及MODS發(fā)病中的變化特點(diǎn)及其作用機制尚缺乏足夠的了解，導致這一領(lǐng)域進(jìn)展緩慢的原因之一是缺乏敏感、快速的金葡菌感染檢測手段。目前臨床上常規的細菌培養與鑒定方法只能說(shuō)明是否為金葡菌感染，而金葡菌產(chǎn)毒試驗也僅是觀(guān)察細菌在體外的產(chǎn)毒情況，并不能反映其在體內的生物活性及致病特點(diǎn)，且該方法耗時(shí)較長(cháng)，致使金葡菌感染的早期診斷非常困難，誤診的情況時(shí)有發(fā)生。因此，建立敏感、快速的金葡菌腸毒素檢測方法用以直接監測外毒素在體內的變化特點(diǎn)，將有助于金葡菌感染所致膿毒癥及MODS的早期識別與診斷，并可望對金葡菌腸毒素致病機制和臨床意義的認識獲得新的進(jìn)展。
我們采用改良雙單抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(BA-ELISA)方法檢測動(dòng)物血漿及組織勻漿中SEB，利用單克隆抗體的特異性和生物素-鏈親素系統的放大原理，使該方法的檢測靈敏度顯著(zhù)升高，可達0.078μg/L，檢測范圍為0.078~20.0μg/L，血漿中SEB的回收率為88.7%~106.2%。建立該方法為進(jìn)一步研究SEB在體內的生物學(xué)效應奠定了技術(shù)基礎。為此，我們采用大鼠20％體表面積Ⅲ度燙傷合并金葡菌攻擊所致嚴重膿毒癥模型，探討了SEB在膿毒癥和多器官功能損害中的變化規律及致病機制。結果顯示，燒傷后金葡菌感染動(dòng)物血漿SEB水平迅速升高，并于6小時(shí)達峰值，其后迅速下降，但至24小時(shí)仍明顯高于傷前值；而心、肝、肺、腎等組織中SEB含量持續上升，其中24小時(shí)升高幅度最為明顯。與其它組織相比，金葡菌嚴重膿毒癥時(shí)肝、腎組織中SEB含量明顯高于其它臟器，表明肝、腎可能是SEB蓄積的主要場(chǎng)所。由于SEB可經(jīng)腎小球自由濾過(guò)，并被近端腎小管細胞完全重吸收，因此腎臟在腸毒素清除中的作用可能尤為重要。據報道，腎動(dòng)脈結扎和腎切除均可導致體內腸毒素的清除延遲，增強其對動(dòng)物的致死能力。給家兔靜脈注射125I標記的腸毒素A后,循環(huán)中腸毒素迅速清除，并分布到肝、腎、肺、脾等組織，其中腎臟含量最高。上述結果進(jìn)一步證實(shí)腎臟是腸毒素蓄積和排泄的最重要場(chǎng)所之一。
研究表明，SEB作為"超抗原"具有很強的絲裂原性，極低濃度即可致T淋巴細胞大量活化、促炎細胞因子產(chǎn)生顯著(zhù)增加，對金葡菌膿毒癥和MODS的病理生理過(guò)程可能具有重要的促進(jìn)作用。我們的資料證實(shí)，SEB對家兔肝臟等多個(gè)器官的功能具有直接損害效應。為了探討SEB在燒傷膿毒癥所致MODS中的作用，我們選取心、肝、肺、腎、腸等重要器官，分析了SEB與器官功能改變的關(guān)系。結果顯示，單純燒傷打擊后24小時(shí)，動(dòng)物心、肝、肺、腎功能明顯異常，但反映小腸黏膜完整性的小腸組織二胺氧化酶活性無(wú)明顯改變。燒傷合并金葡菌攻擊后動(dòng)物肝、腎和心功能損害進(jìn)一步加劇，肺組織中性粒細胞聚集明顯增加；同時(shí)，小腸組織二胺氧化酶活性呈持續下降趨勢，提示小腸黏膜的完整性亦嚴重受損。病理形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)，燒傷后金葡菌感染動(dòng)物心、肝、肺、腎、腸等組織均可見(jiàn)不同程度的炎性細胞浸潤和壞死性病變，其中肺臟改變尤為顯著(zhù)。進(jìn)一步分析發(fā)現，早期給予抗SEB單克隆抗體可有效降低血漿及組織中SEB水平，同時(shí)心、肝功能指標顯著(zhù)降低，小腸組織二胺氧化酶活性基本恢復至傷前范圍。值得注意的是，抗SEB單克隆抗體干預組動(dòng)物早期死亡率明顯降低。上述結果表明，隨著(zhù)組織中SEB含量的降低，動(dòng)物相應器官功能和預后亦在一定程度上得以改善，從而證實(shí)了SEB在MODS中具有重要作用。由此可見(jiàn)，燒傷合并金葡菌攻擊可導致動(dòng)物多器官功能損害進(jìn)一步惡化，其改變與臟器組織中SEB含量持續升高密切相關(guān)。
業(yè)已明確，T淋巴細胞的大量活化是腸毒素所致膿毒癥與MODS重要特征之一。而干擾素-γ(IFN-γ)是活化T淋巴細胞產(chǎn)生的一種強有力的免疫調節因子，在調節單核/巨噬細胞和內皮細胞功能方面作用顯著(zhù)。故推測它在金葡菌膿毒癥及MODS的病理生理過(guò)程中可能具有重要意義。我們的實(shí)驗結果顯示，燒傷合并金葡菌攻擊后0.5小時(shí)，肝、肺等組織中IFN-γ mRNA表達明顯增加，至24小時(shí)仍處于較高水平。與之相似，傷后組織和血漿中IFN-γ含量亦迅速升高。相關(guān)分析表明，肺組織IFN-γ水平與肺臟SEB的含量呈顯著(zhù)正相關(guān)，但內毒素的改變與之無(wú)相關(guān)性。同時(shí)，早期給予抗SEB單克隆抗體可顯著(zhù)抑制血漿及肺組織中IFN-γ的產(chǎn)生，從而證實(shí)SEB可能參與了IFN-γ的誘生過(guò)程。上述結果表明，燒傷后金葡菌攻擊可導致不同組織中IFN-γ基因及蛋白質(zhì)表達廣泛上調，其改變與組織SEB的直接刺激作用有關(guān)。進(jìn)一步分析可見(jiàn)，燒傷后金葡菌感染動(dòng)物肝、肺、腎組織中IFN-γ含量與相應臟器中腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 濃度呈高度正相關(guān)，同時(shí)肺臟IFN-γ含量與局部組織中一氧化氮水平亦呈正相關(guān)關(guān)系。表明IFN-γ可通過(guò)上調TNF-α和一氧化氮等介質(zhì)的誘生在金葡菌膿毒癥所致MODS中具有促進(jìn)作用，抗SEB單克隆抗體干預對動(dòng)物臟器功能的保護效應與其在一定程度上抑制IFN-γ的產(chǎn)生有關(guān)。有資料證實(shí)，SEB攻擊小鼠后體內IFN-γ水平明顯升高，并與一氧化氮的過(guò)度合成與釋放密切相關(guān)；利用抗IFN-γ特異性抗體進(jìn)行早期拮抗能有效抑制一氧化氮的產(chǎn)生，同時(shí)動(dòng)物預后明顯改善，進(jìn)一步證實(shí)了IFN-γ對機體的損害作用。
金葡菌的致病成分較G－菌更為復雜，包括細菌細胞壁成分、胞外酶和外毒素等多種因子。其中腸毒素為金葡菌產(chǎn)生的主要外毒素之一，它在膿毒癥和MODS發(fā)生中的作用及其機制日益引起人們的關(guān)注。一般認為，腸毒素屬"超抗原"，具有強大的抗原刺激能力，且以T淋巴細胞為主要靶細胞。與普通抗原相似，SEB也可與抗原提呈細胞表面的主要組織相容性復合物Ⅱ類(lèi)分子(MHCⅡ)結合形成復合物。其結合部位位于抗原結合槽以外的區域，因此可不經(jīng)加工直接與T淋巴細胞抗原受體的β鏈V區(TCR Vβ)結合。由于TCR Vβ區僅存在有限的基因，核苷酸序列非常保守，同一個(gè)體內的許多T淋巴細胞可具有相同的Vβ成分，因此單一的腸毒素在極低濃度(1~10 μg/L)即可激活大量T淋巴細胞(可達全部T淋巴細胞的5%~10％，甚至40％)�；罨腡淋巴細胞釋放大量促炎細胞因子(如TNF-α、IFN-γ)，最終導致炎癥失控和MODS的發(fā)生。目前研究認為，SEB誘導T淋巴細胞活化有兩種方式，即TCR Vβ限制性方式和不依賴(lài)TCR的方式。正常靜息狀態(tài)的T淋巴細胞不表達MHCⅡ類(lèi)分子，SEB必須先與抗原提呈細胞上的MHCⅡ類(lèi)分子結合，形成毒素-MHCⅡ分子復合物，后者直接與TCR的特異性Vβ鏈結合，經(jīng)磷酯酰肌醇二磷酸和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷等信號轉導途徑誘導T淋巴細胞的活化與增殖，導致炎性細胞因子的大量合成和釋放。與內毒素所致膿毒癥及MODS不同，T淋巴細胞活化和增殖產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ是介導SEB損傷效應的關(guān)鍵環(huán)節，而G－菌膿毒癥中TNF-α誘生主要由單核/巨噬細胞所介導。
眾多研究證實(shí)，急性創(chuàng )、燒傷和休克打擊可導致胃腸道黏膜屏障功能受損、免疫抑制和腸道菌群改變，三者相互作用可促使腸源性?xún)榷舅匾莆恢吝h隔器官，在燒傷膿毒癥和MODS的發(fā)病中具有重要意義。有關(guān)資料亦顯示，盡管G+菌本身不能產(chǎn)生內毒素，但許多G+菌膿毒癥或MODS患者常伴有內毒素血癥的出現，并與G+菌致病因子協(xié)同致病，對MODS的發(fā)生與發(fā)展具有促進(jìn)作用，但其確切的作用機制仍有待探索。動(dòng)物實(shí)驗結果表明，當腸毒素與內毒素共同作用時(shí)，可使各自的致死劑量均降低100倍，而且體內TNF-α、IFN-γ和白介素-6(IL-6)等炎癥介質(zhì)的水平更高、持續時(shí)間更長(cháng)。近年來(lái)大量研究揭示，腸毒素和內毒素的靶細胞雖各不相同 (分別為T(mén)淋巴細胞和單核/巨噬細胞)，但均可通過(guò)各自的細胞表面受體(TCR和CD14)激活細胞內多條信號轉導途徑，最終導致核因子-κB (NF-κB)、信號轉導與轉錄激活子(STAT)等核轉錄因子的活化，后者作為信號轉導途徑的最后"共同通路"，調節著(zhù)體內多種炎癥介質(zhì)的基因轉錄。由此看來(lái)，金葡菌致病因子與內毒素激活炎性細胞的信號轉導存在著(zhù)某些共同途徑，這可能是二者在膿毒癥和MODS發(fā)病中具有協(xié)同作用的重要病理生理學(xué)基礎。以往研究亦證明，腸毒素活化T淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ作為強有力的免疫調節劑可增強單核/巨噬細胞內信號轉導途徑各種激酶的活化程度，促進(jìn)TNF-α等炎癥介質(zhì)的合成與釋放，在腸毒素與內毒素的協(xié)同作用中起著(zhù)關(guān)鍵的調節作用。進(jìn)一步觀(guān)察發(fā)現，IFN-γ可顯著(zhù)增強脂多糖誘導的核轉錄因子NF-κB的活化、促進(jìn)其與DNA結合，而脂多糖反過(guò)來(lái)也可增強IFN-γ所介導的STAT-1的活化，表明二者是通過(guò)對信號轉導途徑的交匯調節(cross-regulate)而產(chǎn)生協(xié)同效應。此外，TNF-α抗體和IL-1受體拮抗劑可有效抑制IFN-γ和脂多糖的協(xié)同效應，表明IFN-γ和脂多糖介導生成的TNF-α、IL-1等細胞因子本身還可通過(guò)"自分泌環(huán)"對協(xié)同效應起到一定的促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，在金葡菌感染誘發(fā)膿毒癥和MODS病理過(guò)程中，腸毒素、內毒素及其介導的細胞因子在信號轉導水平相互調節、相互促進(jìn)，可能是協(xié)同效應的發(fā)生機制之一。應當指出的是，創(chuàng )、燒傷后金葡菌的致病因子較為復雜，除腸毒素外，金葡菌細胞壁成分(如肽聚糖和磷壁酸)在失控性炎癥反應及MODS中的地位亦不容忽視，其確切的病理生理意義有待于深入探討。
作者簡(jiǎn)介：姚詠明(1965-),男(漢族),湖北省人,博士后,教授。主要從事創(chuàng )傷休克、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征發(fā)病機制及防治的研究。
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