雞胚培養技術(shù)—接種與收獲

   （四）接種與收獲 
1、材料 
①來(lái)亨雞白色受精卵、卵架、檢卵燈。 
②碘酒、酒精消毒棉球。 
③滅菌的手術(shù)刀、鑷子、剪刀、平皿。 
④1ml注射器及6號針頭、12號針頭。 
⑤乙型腦炎病毒液、單純皰疹病毒液。 
⑥流感病毒稀釋液。 
⑦磨卵機、透明膠紙。 
2、方法 
   常用接種方法有四種，可根據病毒種類(lèi)、接種目的不同，采用適當的接種途徑。 
（1）卵黃囊接種法 
①取6—8日齡雞胚，在檢卵燈下畫(huà)出氣室和胎位，置卵盤(pán)上，氣室端向上。 
②用碘酊、酒精消毒氣室，然后用磨卵器在氣室中央磨一小孔（用砂輪代替磨卵器也可）。 
③用碘酊、酒精消毒，以12ml注射器吸取乙型腦炎病毒液，針頭自氣室小孔朝胚胎相反方向旁側斜刺入，深度3cm左右，即達卵中心卵黃囊內。注入量0.2—0.5ml，接種后以無(wú)菌蠟封閉小孔。根據接種病毒種類(lèi)不同，置33—37℃溫箱中培養，每天檢卵一次。 
④取孵育24h以上瀕死的雞胚直立于卵盤(pán)上，鈍端向上。氣室部位用碘酊、酒精消毒后，用無(wú)菌鑷子擊破氣室并除去卵殼。用另一無(wú)菌鑷子夾破絨毛尿囊膜和卵膜，取出胚胎，然后夾住卵黃臍帶處，小心收獲卵黃囊。如制涂片，可從中剪一小塊，輕涂于載玻片上，固定、染色、鏡檢�？煞诺蜏乇�箱保存，備用。 
（2）絨毛尿囊膜接種法 
①取10—12日齡雞胚，于檢卵燈上畫(huà)出氣室與胎位，并在胎位無(wú)大血管處畫(huà)一記號。 
②將卵直立于卵架上，鈍端向上，先在氣室部位用碘酊、酒精消毒，用磨卵器或砂輪在氣室中磨一小孔，勿傷卵膜。 
③將卵平放，無(wú)大血管記號處向上，再依次用碘酊、酒精消毒記號處，用磨卵臺或砂輪打一長(cháng)為3—4mm的三角形小口，將卵殼取下，勿損傷殼膜，用注射針頭在殼膜上劃一小縫，勿傷絨毛尿囊膜，將一滴生理鹽水滴于卵膜縫隙處。用針尖刺破氣室囊膜，用大膠球自小孔處吸氣造成負壓，可見(jiàn)生理鹽水下沉，絨毛尿囊膜即凹下，與殼膜已分開(kāi)，人工氣室制造成功。 
④用0.25ml或1ml注射器吸取單純皰疹病毒液0.1—0.2ml，滴于絨毛尿囊膜上，用消毒的熔化石蠟封閉兩口。蠟封部位向上，置37℃孵育4—5d。 
⑤將雞卵取出后用碘酊、酒精消毒，以鑷子揭去人工氣室處卵殼并擴大開(kāi)口，輕提絨毛尿囊膜，用剪子剪下接種面及周?chē)�的絨毛尿囊膜。置于加有無(wú)菌生理鹽水的平皿中觀(guān)察病變及作其他檢驗用。 
（3）尿囊腔接種法 
①常用9—12日齡雞胚，檢卵燈下畫(huà)出氣室界限，并在胚胎旁絨毛尿囊膜發(fā)育良好無(wú)大血管處和氣室交界處畫(huà)一記號。 
②用碘酊、酒精消毒，以磨卵器或砂輪磨一小孔，劃破卵殼不損傷卵膜，以注射器吸取流感病毒液0.05—0.2ml，刺入殼膜少許，即可達尿囊腔。 
③以透明膠紙封閉注射孔，置35—36℃孵育3d取出。 
④為防止出血，收獲前先將雞胚置 ,4℃冰箱冷卻7—12h。取出后用碘酊、酒精消毒氣室端，以鑷子式剪子沿氣室周?chē)�除去卵殼，撕去殼膜。以毛細管或注射器穿破絨毛尿囊膜吸取尿液，置無(wú)菌瓶中備檢。 
（4）羊膜腔接種法 
①取9—11日齡雞胚，該部位接種，孵育雞胚時(shí)，將氣室端向上，讓胎位接近氣室，便于接種。在檢卵燈下畫(huà)出胎位、氣室，用砂輪或磨卵器沿氣室邊緣和胚胎位置靠近處，開(kāi)一道3mm的淺溝，并開(kāi)一不損傷卵膜的孔。 
②用碘酊、酒精消毒，然后用無(wú)菌鑷子揭去殼膜，并滴一滴無(wú)菌液體石蠟以使下面的膜透明，通過(guò)透明的膜，可清楚見(jiàn)到整個(gè)胚胎。 
③用注射器吸取標本，針頭對準開(kāi)口處向雞胚直下，穿過(guò)絨毛尿囊膜、羊膜，進(jìn)入羊膜腔，注入標本0.1—0.2ml，注射后用膠布封口，膠布下墊一無(wú)菌紙塊，然后置35—37℃溫箱孵育3—4d。 
④收獲前將雞胚置4℃冰箱7—12或-4℃冰箱30min，將雞胚凍死，以減少收獲時(shí)出血。撕去膠布，卵殼以碘酊、酒精消毒，用鑷子撕去卵膜。左手持鑷子夾住羊膜腔，右手用毛細管或帶針頭的注射器吸取羊水，放無(wú)菌小試管中備用。 
3、結果觀(guān)察 
  檢查接種標本后的雞胚，是否被病毒感染，有兩種方法：直接法和間接法。 
（1）直接法僅能看到絨毛尿囊膜上是否形成痘瘡，雞胚是否有特殊的病理變化，是否生長(cháng)發(fā)育緩慢或死亡。如皰疹病毒在絨毛尿囊膜上可形成特殊 的痘瘡；流行性乙型腦炎病毒、新城雞瘟病毒可引起雞胚死亡，可用作感染指標，但必須與接種損傷、標本毒性、細菌污染相區別。 
④接種損傷。接種損傷所引起的死亡，通常散在無(wú)規律性，病毒引起的死亡有潛伏期并有一定規律性。 
②標本毒性。毒性引起死亡，標本經(jīng)稀釋后，即不出現死亡。 
③細菌污染。污染引起死亡，尿液呈灰色、渾濁，雞胚無(wú)光澤。 
④排除上述三種情況，可確認為臨床診斷指標。 
（2）間接法：大部分需要雞胚培養后收獲，利用間接法。如流感病毒用尿液和羊水作血凝和血凝抑制試驗；腮腺炎病毒用雞胚的體液、組織及特異性診斷血清作補體結合試驗；狂犬病病毒注入雞胚腦內，收獲后取腦組織作病理切片或直接涂片查找包含體。由于病毒種類(lèi)不同，可選擇不同方法作臨床診斷指標。    
   
   

 

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