利用電子顯微鏡負染標本檢測病毒，其優(yōu)點(diǎn)為：可直接檢測標本，簡(jiǎn)便易行；反差好，能提高分辨率；直觀(guān)地顯示組織或細胞內的病毒，染色后病毒仍保持活性。缺點(diǎn)是：機器價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，不太適用于常規病毒學(xué)診斷試驗或大量標本的檢測；病毒量較大時(shí)才易得到陽(yáng)性結果，應用范圍有限，且不能鑒別病毒的血清型。
1、原理
負染方法是利用染液里的重金屬離子為“染料”，由于病毒標本較重金屬離子電子密度低。電子柬對重金屬離子和病毒標本穿透能力不同，從而使病毒呈現明亮清晰的結構。
2、材料
①20g/l磷鎢酸（PTA）。用雙蒸餾水配制20g/l磷鎢酸溶液，用1mol/lNaOH校正pH值為6.8。
②涂有炭及聚乙烯醇縮甲醛的銅網(wǎng)。
③平皿、濾紙、游絲鑷子、微量毛細管。
3、操作方法
（1）標本制備
①血清。血清0.2—1.0ml，用等量蒸餾水稀釋?zhuān)?500r/min離心，棄上清。沉淀重新懸浮，以肉眼可見(jiàn)折光為宜。
②糞便。取糞便，制成1%懸液，3000r/min離心15—30min，棄沉淀。取上清1500r/min離心30—60min。取沉淀負染或免疫電鏡觀(guān)察。
③尿液。取尿液5—10ml，3000r/min離心30—60min，棄沉淀。取上清液1500r/min離心60min，沉淀稀釋后負染電鏡檢查。
④痰液。痰液標本制備較困難，因為痰液中黏液擾亂背景。必要時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（PBS）1：4稀釋。用勻漿器勻化后1500r/min離心60min，沉淀負染電鏡觀(guān)察。
⑤腦脊液。蒸餾水等量稀釋?zhuān)撊倦婄R觀(guān)察。
⑥絨毛尿囊液。接種病毒培養的尿囊液1500r/min離心60min，沉淀負染電鏡觀(guān)察。
⑦細胞培養。疑似病毒感染的細胞培養連同培養液一起收獲，凍融數次或超聲波破碎后，1500r/min離心60min，沉淀負染電鏡觀(guān)察。
⑧組織塊。用勻漿器或乳缽研磨，1500r/min離心60min，沉淀負染電鏡觀(guān)察。
（2）PTA染色:處理后的標本滴在銅網(wǎng)上，濾紙吸去多余標本，滴加PYA染液，濾紙吸去多余染料，干燥后電鏡觀(guān)察。
4、結果
顯現病毒形態(tài)、結構。
5、注意事項
①超速離心后上清液必須充分吸干再用雙蒸餾水制成懸液，否則殘留的蛋白質(zhì)干擾病毒顆粒的觀(guān)察。
②磷鎢酸不能殺滅病毒，故標本制備后應在火焰上或沸水中消毒，用過(guò)的鑷子、銅網(wǎng)也應消毒。 ③用過(guò)的銅網(wǎng)應用濾紙充分吸干殘留標本，以免污染其他標本出現假陽(yáng)性。
④對未知病毒應將標本稀釋不同倍數，選用清晰的懸液。
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