化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定及注解

   
   化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定及注解
中華人民共和國國家標準
化妝品微生物標準檢驗方法細菌總數測定 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.2－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics 
Standard plate count
細菌總數系指1g或1ml化妝品中所含的活菌，數量。測定細菌總數可用來(lái)判明化妝品被細菌污染的程度，以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設備、工藝流程、操作者的衛生狀況，是對化妝品進(jìn)行衛生學(xué)評價(jià)的綜合依據。
本標準采用標準平板計數法。
1 方法提要
化妝品中污染的細菌種類(lèi)不同，每種細菌都有它一定的生理物質(zhì)性，培養時(shí)對營(yíng)養要求，培養溫度、培養時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等均有所不同。在實(shí)際工作中，不可能做到滿(mǎn)足所有菌的要求，因此所測定的結果，只包括在本方法所使用的條件下（在卵磷脂、吐溫80營(yíng)養瓊脂上，于37℃培養48h)生長(cháng)的一群嗜中溫的需氯及兼性厭氧的細菌總數。
2 培養基和試劑
2.1 生理鹽水：見(jiàn)GB 7918-87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.2 卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養瓊脂培養基
成分： 蛋白胨                20g
牛肉膏                             3g
氯化鈉                            5g
瓊脂                             15g
卵磷脂                           1g
吐溫80                           7g
蒸餾水                    1000ml
制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80將其他成分(除瓊脂外)加到其余蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調pH值為7.1～7.2，加入瓊脂，121℃(15 1b)20min高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。
3 儀器
3.1 錐形燒瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH計或精密pH試紙。
3.4 高壓消毒鍋。
3.5 試管。
3.6 滅菌平皿：直徑9cm。
3.7 滅菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。
3.8 酒精燈。
3.9 恒溫培養箱。
3.10 放大鏡。
4 操作步驟
4.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平甲內，每皿1ml。另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換一支吸管，并充分混勻，使成1:100稀釋液。吸取2ml,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內，每皿1ml。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，······等，每種稀釋度應換1支吸管。
4.2 將熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐溫80、營(yíng)養瓊脂培養基傾注平皿內，每皿約15ml，另傾注一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，作空白對照。隨即轉動(dòng)平皿，使樣品與培養基充分混合均勻，待不瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37℃培養箱內培養48h。
5 菌落計數方法
先用肉眼觀(guān)察，點(diǎn)數菌落數，然后再用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數后。求出同一稀釋度各平皿生長(cháng)的平均菌落數。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(cháng)時(shí)，該平皿不宜計數。若片狀菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計數后乘2，以代表全皿菌落數。
6 菌落計數及報告方法
6.1 首先選取平均菌落數在30～300之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數（見(jiàn)表中例１）。
6.2 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數均在30～300個(gè)之間，則應求出兩者菌落總數之比值來(lái)決定。若其比值小于或等于2應報告其平均數，若大于2則報告其中較小的菌落數(見(jiàn)表中例2及例3)。
6.3 若所有稀釋度的平均菌落數均大于300個(gè)，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見(jiàn)表中例4)。
6.4 若所有稀釋度的平均菌落數均少于30個(gè)，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見(jiàn)表中例5)。
6.5 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見(jiàn)表中例6)。
6.6 若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(cháng)，報告數為每克或每毫升小于10個(gè)。
6.7 菌落計數的報告，菌落數在10以?xún)葧r(shí)，按實(shí)有數值報告之，大于100時(shí)，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個(gè)數，可用10的指數來(lái)表示(見(jiàn)下表報告方式欄)。在報告菌落數為“不可計”時(shí)，應注明樣品的稀釋度。
細菌計數結果及報告方法
 　
附加說(shuō)明：
本標準由中國預防醫學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人周淑玉。
本標準由中國預防醫學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛生監測所負責解釋
注解:
（1）操作注意事項
1）盡量使菌細胞分散開(kāi)，使每個(gè)菌細胞生成一個(gè)菌落，否則將會(huì )導致重大的技術(shù)誤差。
2）制成供試液后，應盡快稀釋?zhuān)�注皿。一般稀釋后應�?小時(shí)內操作完畢。
3）注意抑菌現象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計數結果受影響，如低稀釋時(shí)菌落少。而高釋釋度時(shí)菌落數反而增大。
4) 對照試驗�；瘖y品的稀釋液（特別是1:1O的稀釋液）常帶有化妝品顆粒，有時(shí)與菌落很難區分，為了避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一個(gè)檢樣稀釋液與瓊脂混合的平板，不經(jīng)培養放到4℃環(huán)境中，以便計數檢樣菌落時(shí)用作對照。
另一種防止化妝品顆粒與菌落混淆的方法是培養基中加TTC
（2）細菌總數其他測定法
1) 改良的細菌總數測定法一TTC法
化妝品一般由多種物質(zhì)混合而成，在進(jìn)行細菌測定前雖然經(jīng)過(guò)處理，但有時(shí)還會(huì )存在極難溶解的顆粒,特別是粉類(lèi)化妝品和某些膏霜類(lèi)化妝品�；瘖y品在前處理時(shí)有氣泡產(chǎn)生，顆粒和氣泡容易與細菌菌落相混，影響計數的準確性。
方法：在已熔化的卵磷脂吐-80營(yíng)養瓊脂中，按100ml加入1m1 0.5％的氯化三苯四氮唑（2,3,5 triphenyi terazoloride ，TTC）水溶液之量加入，操作方法同標準法。培養后如系化妝品的顆粒，不見(jiàn)變化，如為細菌，則生成紅色菌落。配好的含TTC培養基，應先用未加TTC的對照，以觀(guān)察其計數是否有不利影響（TTC在一定濃度下對革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用）。
TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。TTC溶液在使用前應在水浴中煮沸半小時(shí)。
原理：無(wú)色的TTC是作為受氫體加入培養基中，如果有細菌存在，培養后在細菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日組成的字，因無(wú)此字）（fomazan），使菌落呈現紅色，其反應式見(jiàn)結構圖：
2）平板表面涂布法
將培養基制成平板，經(jīng)干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“L’形玻璃棒涂布于整個(gè)平板的表面，放置片刻（約10分鐘）將平板翻轉，放入37℃溫箱內培養48小時(shí)，取出進(jìn)行菌落計數，然后乘以5，即為1ml稀釋樣中的菌落數，再乘以稀釋倍數，即得每克（或每毫升）檢樣所含菌落數。
此法的優(yōu)點(diǎn)：菌落生長(cháng)在表面，便于識別和檢查其形態(tài)，與檢樣中的顆粒易區別；細菌不必遭受融化瓊脂的熱力，不致因此而使細菌細胞受到損傷而不生長(cháng)。
此法缺點(diǎn)：取樣量較傾注法少，代表性將受到一定的影響；本來(lái)只有0.2ml的量又被 “L”棒蘸去部分，使菌落數受影響。
（3）菌落計數及報告注意事項
1）如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高，有兩種可能性：一是檢驗工作中發(fā)生差錯；二是受防腐劑影響。這二種情況均不可用作檢樣計數報告的依據。
2）如果平板上出現鏈狀菌落，菌落之間沒(méi)有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時(shí)，一個(gè)細胞塊被分散所造成。一條鏈作為一個(gè)菌落計，如有來(lái)源不同的幾條鏈，每條鏈應作為一個(gè)菌落計，不要把鏈上生長(cháng)的各個(gè)菌落分開(kāi)來(lái)數。此外，如皿內瓊脂凝固后未及時(shí)進(jìn)行培養而遭受昆蟲(chóng)侵入，在昆蟲(chóng)爬過(guò)的地方也會(huì )出現鏈狀菌落，也不應分開(kāi)來(lái)數。
3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可計報告，而應在稀釋最大的平板上，任意數其中兩個(gè)平方厘米中的菌落數，除以2求出lcm2內平均菌落數，乘以皿底面積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數。以此結果作報告，例如：10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀釋度的平板上任意數兩個(gè)平方厘米內的菌落數是60個(gè)，皿底直徑為9cm，則該檢樣每克（或ml）中“估計”菌落數為：
60÷2×63.6×1000＝1.9×106
63.6是按皿底直徑為9cm時(shí)計算而得的面積，如所用乎皿底直徑不是9cm，應另求面積。
4）鑒于檢樣中的細菌是以單個(gè)、成雙、鏈狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現的菌落可以來(lái)源于細胞塊，也可來(lái)源于單個(gè)細胞，故平板上所得需氧和兼性厭氧的菌落數應以單位重量（g）或容量（ml）的菌落形成單位（Colony formingunits CFU）報告更恰當。

 

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