游泳池水中大腸菌群檢驗方法

   
   一、大腸菌群多管發(fā)酵法測定
1定義
大腸菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培養24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
2 儀器
見(jiàn)《公共場(chǎng)茶具的大腸菌群測定方法》。
3培養基和試劑
3.1乳糖蛋白胨培養液
3.1.1成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 2g
乳糖 5g
氯化鈉 5g
1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
蒸餾水 1000mL
三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液按上述乳糖蛋白胨培養液濃縮三倍配制。
3.1.2配法：將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1000ml蒸餾水中加熱溶解，調pH到]7.2～7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示劑，充分混勻，分裝到含有倒管的試管中，115℃高壓滅菌15min。
3.2伊紅美蘭瓊脂
見(jiàn)《公共場(chǎng)所茶具的大腸菌群測定方法》。
3.3革蘭氏染色液
風(fēng)《公共場(chǎng)所茶具的大腸菌群測定方法》。
3.4染色法
見(jiàn)《公共場(chǎng)所茶具的大腸菌群測定方法》。
4推測性試驗
4.1在2個(gè)裝有50ml三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的大試管或燒杯內各加入水樣100ml。
4.2在10支裝有5ml三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的試管里各加入水樣10ml。
4.3輕搖試管，使液體充分混勻，置36±1℃培養箱中，培養24h。
4.4觀(guān)察每管是否產(chǎn)氣，如不產(chǎn)氣則報告為大腸菌群陰性；若有氣體產(chǎn)生則為推測性試驗陽(yáng)性，需做進(jìn)一步的證實(shí)試驗。
5證實(shí)試驗
5.1平板分離
自推測性檢驗陽(yáng)性管中取一接種環(huán)培養液，接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃培養箱培養18～24h，觀(guān)察菌落形態(tài)，典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色，具有金屬光澤。
5.2復發(fā)酵試驗
挑取可疑大腸菌群菌落1或2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，于36±1℃培養箱中，培養24h。
5.3凡乳糖發(fā)酵管最終產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的最大可能數（MPN）檢索表得出1000ml水樣中總大腸菌群的MPN值。
　
　
　
總大腸菌群（MPN）檢索表
100mL水量的陽(yáng)性管數
 100mL水量的陽(yáng)性管（瓶）數 
0 1 2 
每L水樣中總大腸菌群 每L水樣中總大腸菌群數 每L水樣中總大腸菌群數 
二、大腸菌群濾膜法測定
1 定義        
大腸菌群（coliform bacteria）為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，將帶菌濾膜貼在含乳糖的選擇性培養基上，經(jīng)37℃培養24小時(shí)后，呈現深暗紅色帶金屬光澤的菌落。
2儀器
2.1濾器
2.2濾膜:乳徑0.45m m。直徑根據濾器規格，目前常用的有35mm和27mm兩種。
2.3抽濾設備
2.4無(wú)齒鑷子
2.5其它儀器見(jiàn)《公共場(chǎng)所茶具的大腸菌群檢驗方法》
3培養基
3.1品紅亞硫酸鈉培養基
3.1.1成分：蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
瓊脂 10～20g
磷酸氫二鉀 3.5g
無(wú)水亞硫酸鈉 5g
5%堿性品紅乙醇溶液 20mL
蒸餾水 1000mL
3.1.2儲備培養基的制備
將磷酸氫二鉀、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸餾水的燒杯中，溶解后調pH值到7.2～7.4，加入瓊脂加熱溶解，用蒸餾水補足至1000ml，趁熱用脫脂棉或絨布過(guò)濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶?jì)龋?nbsp;115℃高壓滅菌20min，置冷暗處備用。
3.1.3平皿培養基的制備
將上述培養基加熱融化，根據培養基的用量，堿性品戲乙醇溶液與培養基按1：50的比例，用滅菌吸管吸取一定量的堿性品紅溶液置于滅菌空試管中。再按1：200的比例稱(chēng)取所需的無(wú)水亞硫酸鈉置于另一個(gè)來(lái)菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解，在沸水浴中煮沸滅菌10min。
用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉紅色為止。將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的儲備培養基中，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡），立即將此種培養基適量?jì)A入滅菌的空平皿內， 待其冷卻凝固后置冰箱內備用。此培養基于冰箱中保存不宜超過(guò)兩周，如培養基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。
3.2乳糖蛋白胨培養液
見(jiàn)《游泳池水中大腸菌群多管發(fā)酵測定法》
4操作步驟
4.1濾膜滅菌：將濾膜放入含蒸餾水的燒杯中，煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮混后需更換水洗滌2～3次，以除去留溶劑。
4.2濾器滅菌：用121℃高壓滅菌20min或用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌。
4.3水樣過(guò)濾：用無(wú)菌鑷子夾滅菌濾膜邊緣部分，將濾膜粗糙面向上，貼放在濾床上。固定好濾器，將100ml水注入濾器中,打開(kāi)濾器閥門(mén)。在-0.5大氣壓下抽濾。
4.4培養：水樣濾室外后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門(mén)，取下濾器。用滅菌鑷子夾濾膜邊緣部分，移放在乳糖瓊脂分離培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者之間不得留有氣泡。然后將平皿倒置，放入36±1℃恒溫箱內培養18～24h。
4.5挑取濾膜上符合下列特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。
紫紅色，具有金屬光澤的菌落；
深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；
淡紅色，中心色較深的菌落。
4.6將革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌接種到乳糖蛋白胨培養液中，于36±1℃培養48h。產(chǎn)酸產(chǎn)氣者證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性。
5檢驗結果報告
計算濾膜上生長(cháng)的證實(shí)為大腸菌群的菌落數，再乘以10即為每1000ml水樣中的大腸菌群數。

 

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