菌種保存、使用及限用時(shí)間技術(shù)指南

  微生物菌種是生物醫藥、食品工業(yè)、環(huán)境修復等領(lǐng)域的核心資源�？茖W(xué)規范的菌種保存與管理不僅能確保其遺傳穩定性與功能活性，還可為科研數據的可重復性和工業(yè)生產(chǎn)的一致性提供保障。隨著(zhù)生物技術(shù)的快速發(fā)展，菌種保存技術(shù)不斷革新，但實(shí)驗室與工業(yè)場(chǎng)景中仍面臨保存方法選擇不當、菌種污染、活性衰減等問(wèn)題。本文整合了菌種保存、使用及限用時(shí)間管理的全流程技術(shù)要點(diǎn)，并結合前沿技術(shù)展望，為從業(yè)者提供系統性指導。

一、菌種保存的核心原則與技術(shù)分類(lèi)

1、保存原則

  菌種保存需圍繞以下核心目標展開(kāi)：維持遺傳穩定性，避免基因突變或表型漂變；確保高存活率，通過(guò)環(huán)境控制減少細胞損傷；延長(cháng)保存周期，根據需求選擇短期、中期或長(cháng)期保存方案。

菌種保存的基本原則包括：低溫抑制代謝（-20℃至-196℃），脫水減少冰晶損傷（如凍干法），隔絕氧氣延緩氧化（液體石蠟覆蓋），營(yíng)養限制降低代謝速率（貧營(yíng)養培養基）。

2、保存技術(shù)分類(lèi)

  根據保存時(shí)長(cháng)與適用場(chǎng)景，菌種保存方法可分為三類(lèi)：短期保存（≤6個(gè)月），如斜面低溫法；中期保存（1-10年），液體石蠟法、甘油管冷凍法、凍干法、瓷珠吸附法；長(cháng)期保存（≥10年），液氮超低溫法。

二、菌種保存技術(shù)詳解

1、斜面低溫保存法

  （1）步驟：接種菌種至斜面培養基，37℃培養至對數生長(cháng)期；密封后4℃±1℃避光保存。

  （2）適用菌種：大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌等常溫菌。

  （3）優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設備，適合實(shí)驗室日常使用；菌種活性恢復快，便于頻繁取用；成本低廉，僅需普通冰箱即可完成保存。

  缺點(diǎn)：保存周期短（1-3個(gè)月），需頻繁傳代；易受污染或發(fā)生表型變異；培養基易干裂，需定期檢查密封性。

  （4）注意事項：每月轉接一次，避免培養基干裂；添加磷酸鹽緩沖液可延緩代謝產(chǎn)酸。

2、液體石蠟覆蓋法

  （1）操作：無(wú)菌石蠟油覆蓋斜面，油層厚度≥1 cm，直立保存。

  （2）適用菌株：兼性厭氧菌和酵母菌。

  （3）優(yōu)點(diǎn)：隔絕氧氣，保存期延長(cháng)至6-12個(gè)月；成本較低，僅需滅菌液體石蠟。

  缺點(diǎn)：不適用于嚴格厭氧菌（石蠟滲透可能阻礙氣體交換）；石蠟層過(guò)薄可能導致培養基脫水；復蘇時(shí)需清除石蠟殘留，操作繁瑣。

3、甘油管冷凍法

  （1）配方：20%-40%甘油與菌懸液（OD600≈1.0）混合，分裝后-80℃保存。

  （2）優(yōu)點(diǎn)：適用范圍廣（細菌、真菌、放線(xiàn)菌）；保存期長(cháng)（2-5年），年均存活率下降僅1%-2%；復蘇便捷，可直接劃板接種。

  缺點(diǎn)：依賴(lài)-80℃超低溫冰箱，設備成本較高；反復凍融會(huì )導致菌種活性顯著(zhù)下降；高濃度甘油可能抑制部分菌種生長(cháng)。

4、冷凍干燥法（凍干法）

  （1）核心工藝：菌體與保護劑（10%脫脂乳或海藻糖）混合；預凍至-50℃以下；真空干燥（0.1 mbar-1 mbar，24 h-72 h）。

  （2）優(yōu)點(diǎn)：保存期長(cháng)達5-15年，存活率≥70%；菌種代謝完全停滯，遺傳穩定性高；便于運輸和長(cháng)期保藏（如標準菌株庫）。

  缺點(diǎn)：設備昂貴（需凍干機、真空泵等）；操作流程復雜，預凍與干燥時(shí)間長(cháng)達24 h-72 h；對部分脆弱菌種（如某些古菌）存活率較低。

5、瓷珠保藏法

  （1）步驟：菌懸液吸附于無(wú)菌瓷珠，冷凍保存；復蘇時(shí)取單顆瓷珠接種。

  （2）優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)未畏盅b多顆瓷珠，避免反復凍融；高通量管理，適合大規模菌種庫；復蘇便捷，直接取單珠接種。

  缺點(diǎn)：初期需購置專(zhuān)用瓷珠和分裝設備；吸附效率受菌懸液濃度影響；長(cháng)期保存需依賴(lài)超低溫設備（-80℃或液氮）。

6、液氮超低溫保存

  （1）程序：梯度降溫（1℃/min）至-196℃，保護劑為5%-10% DMSO或甘油。

  （2）優(yōu)點(diǎn)：保存期最長(cháng)（≥10年），存活率幾乎無(wú)衰減；適用于所有微生物類(lèi)型，包括極端嗜熱/嗜冷菌；細胞代謝完全停滯，避免遺傳變異。

  缺點(diǎn)：液氮罐維護成本高，需定期補充液氮；操作風(fēng)險大（液氮泄漏或凍傷）；梯度降溫程序復雜，需專(zhuān)業(yè)培訓。

  （3）注意事項：需定期補充液氮，避免溫度波動(dòng)＞5℃。

三、菌種復蘇方法

1、斜面低溫保存菌種

  （1）步驟：從4℃冰箱取出斜面菌種，檢查密封性及培養基狀態(tài)（無(wú)干裂、污染）；用接種環(huán)無(wú)菌挑取少量菌苔；劃線(xiàn)接種至新鮮固體培養基；按菌種生長(cháng)條件（如37℃）培養18-24小時(shí)，觀(guān)察菌落形態(tài)。

  （2）注意事項：若斜面干燥或菌苔稀疏，需延長(cháng)培養時(shí)間或重新活化；避免多次挑取同一斜面，防止污染。

2、甘油管冷凍菌種（-80℃）

  （1）步驟：從超低溫冰箱中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中搖晃解凍（≤2分鐘）；用無(wú)菌吸管吸取50 μL-100 μL菌液，直接劃線(xiàn)接種至固體培養基；剩余菌液可短期保存于4℃（≤24小時(shí)），避免反復凍融。

  （2）注意事項：快速解凍：緩慢解凍易導致冰晶損傷細胞；梯度稀釋法：若菌液濃度過(guò)高，需用無(wú)菌生理鹽水稀釋后接種（如10-1至10-3梯度）。

3、凍干菌種

  （1）步驟：無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)啟凍干管（火焰灼燒管口或使用專(zhuān)用開(kāi)瓶器）；加入0.5 mL-1 mL適宜液體培養基（如TSB）或復蘇液（含0.1%蛋白胨）；輕搖使菌粉充分溶解；取100 μL菌懸液劃線(xiàn)接種至固體培養基，剩余液體可短期保存于4℃。

  （2）注意事項：復蘇液選擇：優(yōu)先使用菌種原始培養基成分；避免震蕩：劇烈搖晃可能損傷復蘇細胞。

4、瓷珠保藏菌種

  （1）步驟：從-80℃冰箱中取出瓷珠管；用無(wú)菌鑷子夾取1顆瓷珠，直接滾動(dòng)接種至固體培養基；剩余瓷珠立即放回低溫保存，避免反復凍融。

  （2）注意事項：無(wú)需解凍：瓷珠可直接接種，減少復蘇時(shí)間；吸附效率：若菌量不足，可同時(shí)使用多顆瓷珠。

5、液氮超低溫保存菌種

  （1）步驟：佩戴防凍手套，從液氮罐中取出凍存管（避免直接接觸液氮）；迅速轉移至37℃水浴中快速解凍（≤1分鐘）；用75%酒精擦拭凍存管外壁消毒；無(wú)菌條件下打開(kāi)管蓋，吸取菌液接種至預還原培養基（厭氧菌需在厭氧工作站操作）。

  （2）注意事項：梯度降溫菌種：若采用程序降溫，需按原降溫速率反向復溫（需專(zhuān)用設備）；嚴格無(wú)菌：液氮可能被微生物污染，需徹底消毒管壁。

四、通用復蘇注意事項

  1、無(wú)菌操作：全程在生物安全柜或酒精燈火焰附近操作；凍存管開(kāi)啟前需酒精消毒表面。

  2、溫度控制：冷凍菌種需快速解凍，避免冰晶重結晶損傷細胞；嗜冷菌復蘇溫度應匹配其生長(cháng)需求（如4℃-15℃）。

  3、培養基選擇：優(yōu)先使用高營(yíng)養培養基（如TSA、LB），促進(jìn)菌種快速增殖；特殊菌種需添加生長(cháng)因子（如血紅素、維生素）。

  4、復蘇后處理：初次復蘇菌種需連續傳代2-3次，恢復代謝活性；嚴格記錄復蘇日期及代數，避免超代使用。

  5、傳代次數限制：標準菌株≤3代，生產(chǎn)菌種≤5代，每代需進(jìn)行功能驗證。

五、保存期限影響因素與限用時(shí)間管理

1、保存方法差異

2、限用時(shí)間確定原則

  （1）菌種特性：易變異菌種（如病毒）限用時(shí)間≤6個(gè)月，穩定性菌株（如枯草芽孢桿菌）可延至2年。

  （2）保存條件：4℃保存的限用時(shí)間為冷凍保存的1/3。

  （3）使用頻率：高頻率使用菌種建議縮短至原期限的50%。

3、失效判定與處置

  （1）質(zhì)控紅線(xiàn)：存活率＜10³ CFU/mL、傳代次數超限、表型變異率＞5%。

  （2）異常處理：污染菌種立即銷(xiāo)毀，活性喪失需重新復蘇備份。

六、相關(guān)產(chǎn)品

1、部門(mén)斜面產(chǎn)品

2、部分瓷珠菌種產(chǎn)品

3、部分凍干質(zhì)控菌株產(chǎn)品

注:本文屬海博生物原創(chuàng ),未經(jīng)允許不得轉載。

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