原代細胞的分離及培養

  凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養的細胞稱(chēng)為原代細胞。原代細胞培養是生物學(xué)研究和醫學(xué)研究中常用的技術(shù)，它可以幫助我們更深入的了解細胞的生物學(xué)行為、疾病機制等。

一、取材

  1、組織來(lái)源

  物種來(lái)源：根據實(shí)驗目的選擇人、大鼠、小鼠等不同物種的組織。

  組織類(lèi)型：優(yōu)先選擇新鮮、健康的組織（如胚胎組織、幼體組織，因其細胞增殖能力強），去除無(wú)用組織，避免干燥。

  無(wú)菌取材：解剖時(shí)需嚴格無(wú)菌操作，避免微生物污染、機械損傷。

  2、各類(lèi)組織的取材技術(shù)

  皮膚和粘膜：主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法類(lèi)似于外科取斷層皮片手術(shù)操作，面積一般為2 cm²-4 cm²。

  血液：血細胞、淋巴細胞的的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等）分離細胞，取材時(shí)應注意抗凝。

  內臟和實(shí)體瘤：內臟取材時(shí)應明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位；實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細胞豐富的區域，避開(kāi)破損、壞死、液化部分，盡量去除混雜的結締組織。

二、分離和制作

  1、機械分離法

  將組織剪碎至1 mm³-3 mm³小塊，用無(wú)菌篩網(wǎng)（100目-200目）過(guò)濾去除纖維碎片，離心（800 rpm -1000 rpm，5 min）收集細胞懸液。適用于較堅韌的組織（腫瘤、軟骨等）。

  2、消化分離法

  消化分離法常用胰蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶，將組織剪碎后浸泡于含酶的消化液（37℃預熱），37℃振蕩消化15 min-30 min（時(shí)間依組織類(lèi)型調整），加入含血清的培養基終止消化（血清可抑制酶活性），離心（1000 rpm，5 min）后重懸細胞。

三、原代細胞培養

  1、貼壁細胞

  細胞接種時(shí)通過(guò)PBS緩沖液充分漂洗，盡量去除消化液，密度約為1×10⁵cell/mL -1×10⁶cell/mL，接種于培養瓶，初次培養時(shí)可保留部分組織塊貼壁（組織塊法可促進(jìn)細胞遷出）�；�礎培養基使用DMEM、RPMI 1640或MEM（根據細胞類(lèi)型選擇），添加10%-20%胎牛血清及必要的生長(cháng)因子（如EGF、bFGF用于干細胞），37℃、5% CO₂培養。

  起始48 h中盡量減少振蕩，防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂��；待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應將原代細胞換液；用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養7 d時(shí)，應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液。

  2、懸浮細胞

  原代培養時(shí)應盡量去除紅細胞，長(cháng)期培養時(shí)，淋巴細胞中要加入生長(cháng)因子，白血病細胞中加入少量的原患者血清，維持細胞生長(cháng)。細胞換液一般每隔3 d半量換液一次。

四、注意事項

  原代細胞的分離和培養過(guò)程需要特別注意無(wú)菌操作和細胞的養護，以保證細胞的健康和活性。

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