微生物基因工程：基因編輯相關(guān)介紹

引言

  微生物基因編輯是通過(guò)人工手段對微生物（如細菌、酵母等）的基因組進(jìn)行精確修改的技術(shù)，其核心原理是利用特定的工具靶向定位基因組中的目標位點(diǎn)，并通過(guò)DNA的切割和修復機制實(shí)現基因的插入、刪除或替換。

一、微生物基因編輯技術(shù)介紹

  基因編輯的核心步驟

  1.靶向定位

  工具選擇：使用特定分子工具（如CRISPR-Cas系統、鋅指核酸酶ZFN、TALEN等）精準識別基因組中的目標DNA序列。

  2.DNA切割

  雙鏈斷裂（DSB）：核酸酶（如Cas9）在靶點(diǎn)處切割DNA雙鏈，形成雙鏈斷裂。

  單鏈切割：某些工具（如Cas9 nickase）僅切割單鏈，降低脫靶風(fēng)險。

  3.DNA修復與編輯

  DNA斷裂后，細胞會(huì )啟動(dòng)修復機制，利用以下兩種途徑實(shí)現基因編輯：非同源末端連接（NHEJ）：直接修復斷裂的DNA，但可能引入插入或缺失，導致基因敲除。用于破壞特定基因功能；同源定向修復（HDR）：以提供的同源修復模板（供體DNA）為參考，精確插入或替換目標序列。用于基因敲入、點(diǎn)突變或大片段插入。

二、基因編輯工具的迭代

  1.傳統同源重組

  同源重組（Homologous Recombination）是一種依賴(lài)DNA序列同源性進(jìn)行精確修復或重排的分子機制，廣泛存在于細菌、酵母、動(dòng)植物等生物中。在基因編輯中，同源重組被用于通過(guò)人工設計的同源修復模板（供體DNA）對目標基因組進(jìn)行精準修改，如基因敲入（Knock-in）、點(diǎn)突變或大片段替換。

  2.CRISPR-Cas系統

  CRISPR/Cas9系統：利用向導RNA（sgRNA）與Cas9蛋白協(xié)同作用，通過(guò)PAM序列定位靶點(diǎn)，實(shí)現精準切割。操作簡(jiǎn)便、成本低、效率高，是目前最主流的基因編輯工具。其大致流程為：設計gRNA，使其與目標DNA序列互補；將gRNA與Cas9蛋白（或編碼質(zhì)粒）導入微生物細胞；Cas9-gRNA復合體切割靶DNA，觸發(fā)修復機制；結合供體DNA模板實(shí)現精確編輯。

  3.轉座子與重組酶系統

  利用轉座酶（如Tn）或位點(diǎn)特異性重組酶（如Cre-LoxP系統）實(shí)現DNA片段的插入或刪除。

  轉座酶為執行轉座功能的酶，通常由轉座子編碼，識別轉座子兩端的特異序列，能把轉座子從相鄰序列中脫離出來(lái)，再插入到新的DNA靶位點(diǎn)，無(wú)同源性要求。

  特異性重組酶Cre酶是一種特異性重組酶，其在作用時(shí)重組率更高。比如構建的質(zhì)粒的同源臂上存在兩處loxP位點(diǎn)，分別位于待敲除基因的兩端，而Cre擁有不需要factor就能將loxP位點(diǎn)間基因進(jìn)行敲除和重組的能力，無(wú)需雙鏈斷裂，但編輯位點(diǎn)受限于酶的特異性。

三、微生物基因編輯的驗證

  1.分子水平驗證

  1）PCR擴增與電泳分析：檢測目標基因是否被插入、刪除或替換。

  2）測序分析：確認編輯位點(diǎn)的序列準確性，排除非預期突變。

  3）qPCR或數字PCR：檢測基因拷貝數變化。

  4）蛋白水平驗證（Western Blot）：確認目標基因的表達變化（如基因敲除后蛋白缺失，或外源基因表達）。

  2.表型水平驗證

  1）抗性篩選與菌落PCR：結合選擇標記（如抗生素抗性基因）篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)一步驗證。

  2）功能表型檢測：通過(guò)生物學(xué)功能變化確認基因編輯效果。代謝缺陷，若敲除某代謝基因，菌株可能在特定培養基上無(wú)法生長(cháng)；或基因表達，插入熒光蛋白或酶基因，通過(guò)顯色或熒光觀(guān)察表達情況。

  3）微生物生長(cháng)曲線(xiàn)分析：檢測編輯是否影響微生物的生長(cháng)特性。

  3.其他驗證技術(shù)

  1）熒光報告系統：實(shí)時(shí)監測基因編輯效率，構建含熒光蛋白（如mCherry）的報告質(zhì)粒，當編輯工具激活時(shí)熒光信號消失或增強。

  2）單菌落分離與純化：避免混合克隆干擾驗證結果，將轉化后的菌液稀釋涂板，挑取單菌落擴增后驗證。

四、結語(yǔ)

  微生物基因編輯的核心在于精準靶向、可控切割和高效修復。CRISPR技術(shù)的出現大幅提升了編輯效率和靈活性，但不同微生物需適配特定工具和條件。未來(lái)隨著(zhù)合成生物學(xué)和基因遞送技術(shù)的進(jìn)步，微生物基因編輯將在生物制造、醫療健康等領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

五、微生物基因工程相關(guān)培養基的采購

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注：本文屬海博生物原創(chuàng )，未經(jīng)允許不得轉載。

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